L'apoptose est un processus physiologique de mort cellulaire

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Introduction


L'apoptose est un processus physiologique de mort cellulaire au cours duquel des mécanismes complexes sont activés pour aboutir à la destruction de la cellule. Ce « suicide cellulaire » est un événement clé en biologie car il permet l'équilibre entre prolifération et dégénérescence cellulaire dans les organismes pluricellulaires, c'est à dire le maintien de leur homéostasie. De plus, l'apoptose est un mécanisme « silencieux » pour l'organisme et il permet donc la régulation des populations cellulaires tout en respectant l'intégrité de l'organisme.

L'apoptose survient naturellement au cours de l'embryogenèse, du renouvellement tissulaire et lors du vieillissement. Cependant, elle peut également se produire dans diverses conditions pathologiques. De plus, un dysfonctionnement des mécanismes régulateurs de l'apoptose va donner lieu à de graves pathologies. Ainsi, un défaut d'apoptose va entraîner des syndromes prolifératifs associés à un processus de tumorisation, tout particulièrement au niveau des tissus à renouvellement rapide comme le système immunitaire (lymphome, leucémie). A l'inverse, une activation anormale va donner lieu à un phénomène de dégénérescence, comme cela est observé au cours de nombreuses maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, ou la sclérose latérale amyotrophique.

Parmi les molécules impliquées dans l'activation du processus apoptotique, le récepteur Fas (Apo 1 ou CD95) est l'un des plus étudiés. Fas est un récepteur appartenant à la superfamille des récepteurs au tumor necrosis factor (TNF) / nerve growth factor (NGF). La fixation de son ligand naturel (FasL), ou d'un anticorps anti-Fas agoniste, permet son oligomérisation et entraîne le recrutement et l'activation de la caspase-8 grâce à la protéine adaptatrice FADD (« Fas associated death domain »). La caspase-8 va à son tour activer la caspase-3, soit directement par clivage, soit en activant la voie apoptotique mitochondriale. La caspase-3, véritable exécutrice de l'apoptose, va permettre l'activation des molécules effectrices de l'apoptose.

Le récepteur Fas joue un rôle crucial au niveau du système immunitaire, tant pour la régulation des populations lymphocytaires après une réponse immunitaire, que pour le maintien dans l'organisme de la tolérance aux autoantigènes. Au cours de la réponse immunitaire, le récepteur Fas va également être impliqué dans l'élimination des cellules infectées par des virus ou des parasites, ou des cellules tumorales. Bien que l'expression et le rôle de la protéine Fas dans le système nerveux ne soient pas clairement définis, elle a été impliquée au cours de pathologies neurodégénératives telles que l'ischémie ou la maladie d'Alzheimer.

Des travaux antérieurs au laboratoire suggéraient que le récepteur pro-apoptotique Fas jouait également un rôle dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA). La SLA est une pathologie grave du système nerveux central au cours de laquelle on observe une dégénérescence sélective des neurones moteurs. Cette destruction des motoneurones entraîne une paralysie musculaire progressive, puis la mort, qui survient entre 3 et 5 ans après l'identification des premiers signes cliniques. Les mécanismes qui entraînent l'apparition d'une SLA ne sont pas encore clairement identifiés, mais seules 10 % des formes sont familiales. Plusieurs hypothèses ont été largement étayées quant aux causes des formes sporadiques, telles que l'excitotoxicité, le stress oxydatif, des modifications du cytosquelette et l'autoimmunité. Ces différents facteurs suggèrent que l'étiologie de la SLA est multifactorielle, mais il est toutefois intéressant de noter que des immunoglobulines (Ig) monoclonales sont retrouvées dans 60 % des sérums de malades. De ce fait, des anomalies immunitaires sont potentiellement associées à la SLA, bien que l'on ignore actuellement si les désordres auto-immuns sont à l'origine de la pathologie ou bien s'il s'agit d'une de ses conséquences qui aggrave éventuellement la neurodégénerescence.

Le but de cette étude était initialement d'étudier les facteurs sériques pro-apoptotiques présents dans le sérum de malades atteints de SLA. Il s'agit d'autoanticorps anti-Fas inducteurs d'apoptose motoneuronale. De ce fait, l'expression du récepteur Fas par des motoneurones du système nerveux central a été recherchée dans des cultures contenant des motoneurones murins.

Afin de relier les résultats obtenus au cours de cette étude à la pathologie humaine, l'expression et le rôle du récepteur Fas ont également été étudiés au niveau des motoneurones foetaux humains, et d'une lignée neuroblastique humaine.

Pour préciser le rôle pathogène d'autoanticorps anti-Fas au cours de la SLA, et pour rechercher une possible spécificité cellulaire de la protéine Fas, nous avons étudié des souris immunisées par Fas et produisant des anticorps anti-Fas. Ces immunisations ont été obtenues avec des protéines Fas extraites soit de cellules neuroblastiques, soit de cellules lymphocytaires T humaines.

Enfin, une nouvelle régulation de la voie de signalisation apoptotique du récepteur Fas, par des phosphorylations extracellulaires, a été mise en évidence dans les cellules de la lignée lymphocytaire T Jurkat.

DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES


Première partie : L'APOPTOSE
.I Apoptose et nécrose
L'apoptose est un phénomène actif, génétiquement contrôlé, qui aboutit à la mort des cellules sénescentes ou endommagées. Ce phénomène a été identifié par Kerr et al. (1972) au cours d'une étude sur l'ischémie hépatique. Ces auteurs ont décrit deux modes distincts de mort cellulaire sur la base de critères morphologiques. Le premier type de mort cellulaire, dénommé nécrose, est caractérisé par une augmentation rapide du volume cellulaire, la perte précoce de l'intégrité membranaire et mitochondriale, et le relargage du contenu lysosomial provoquant une lésion et une réaction inflammatoire au niveau du tissu environnant. Au contraire, l'apoptose se caractérise par le maintien de l'intégrité membranaire jusque dans les phases tardives du processus et une diminution du volume cellulaire. La structure des organelles est préservée alors que la chromatine se condense et se fragmente. La cellule se fragmente également en corps apoptotiques mais préserve son contenu lysosomial. In vivo, ces corps apoptotiques sont alors phagocytés alors qu'ils subissent, in vitro, un processus de nécrose secondaire. Enfin, à la différence de la nécrose, l'apoptose ne déclenche pas, in vivo, de réaction inflammatoire.

L'apoptose est un processus physiologique de mort cellulaire faisant appel à la mise en oeuvre d'un véritable programme de destruction de la cellule. Ce « suicide cellulaire » est un événement clé en biologie qui survient naturellement au cours de l'embryogenèse, du renouvellement tissulaire et lors du vieillissement. Il peut également se produire dans des conditions pathologiques variées telles que l'infection virale, l'hypoxie ou l'exposition à des toxines. La nécrose, qui se produit de façon accidentelle, est un processus relativement bien connu. Cependant, l'apoptose est un phénomène complexe qui nécessite l'exécution d'un programme génétique bien ordonné. Ces deux processus se caractérisent par des circonstances de survenue, des modifications morphologiques et des mécanismes moléculaires distincts.

.I.1 La nécrose
La mort cellulaire nécrotique est un processus passif résultant d'une séquence d'événements cellulaires et tissulaires, qui survient à la suite de perturbations profondes de l'environnement cellulaire. Elle se produit dans des conditions pathologiques telles que l'hypoxie sévère, la privation de glucose, le traumatisme, la variation de l'osmolarité, de la température de l'environnement, et du pH, ainsi qu'à l'exposition à des toxines et des agents infectieux. A l'échelle du tissu ou de l'organe, la nécrose peut affecter un groupe de cellules contiguës. Les cellules attenantes, en libérant des substances toxiques pour les cellules voisines, entraînent une expansion du phénomène nécrotique. La nécrose conduit à une perte cellulaire toujours secondaire à des conditions pathologiques (Choi et al., 1999) et elle se caractérise de façon constante par une réaction inflammatoire.

Les anomalies morphologiques observées dans la nécrose résultent des perturbations des fonctions cellulaires. Au niveau de la cellule, deux phénomènes principaux conduisent irréversiblement à la mort des cellules nécrotiques affectées : la perte de l'intégrité membranaire et l'altération des fonctions mitochondriales. Dans la mort cellulaire par nécrose, un des premiers événements est la rupture de la membrane plasmique et donc la perte de sa capacité à réguler les gradients osmotiques et ioniques. Cela engendre une entrée massive d'eau accompagnée d'électrolytes, provoquant ainsi un gonflement de la cellule et une augmentation de la perméabilité aux molécules extracellulaires. Ainsi les morphologies cellulaires sont rapidement modifiées et vont s'accompagner d'une augmentation du volume cellulaire, d'un gonflement des organites et du noyau.

Dans le cytoplasme, les organites commencent à dégénérer et de profondes perturbations de l'activité mitochondriale sont observées. La mitochondrie et le réticulum endoplasmique se dilatent, des vacuoles intracytoplasmiques se forment et les polysomes se détachent du réticulum endoplasmique. Les organites intracellulaires sont dispersés dans l'espace extracellulaire. La structure nucléaire est également perturbée, le noyau est gonflé et la chromatine digérée par des protéases et des endonucléases et ainsi l'ADN nucléaire va être dégradé de manière ' aléatoire ' (Bicknell et Cohen, 1995 ; Dong et al., 1997) générant des fragments dépourvus d'extrémité 3' sortante.

La masse de cellules nécrotiques peut se limiter à une nécrose localisée, ou évoluer vers une nécrose diffuse qui résulte de l'action d'enzymes lysosomiales dérivées de la cellule elle-même (autolyse) ou de celles voisines (hétérolyse). La mort cellulaire par nécrose déclenche souvent une forte réaction inflammatoire locale. Les cellules nécrotiques lysées libèrent des substances dont les leucotriènes qui sont générés par la péroxydation des lipides membranaires, et des composants de la mitochondrie activant le complément (Giclas et al., 1979) qui ne sont pas encore identifiés (Kagiyama et al., 1989). Ces substances induisent une réaction inflammatoire typique de la nécrose (Kroemer et al, 1998) et les débris cellulaires sont alors phagocytés par les cellules immunitaires de l'inflammation.

.I.2 L'apoptose
Toutes les cellules ont la capacité de se détruire en activant un programme intrinsèque dont l'exécution conduit à une forme de mort cellulaire, l'apoptose. Par opposition à la nécrose, l'apoptose est considérée comme une mort cellulaire 'ordonnée', procédant par différentes phases (Kerr et al., 1972 ; Duvall and Wyllie, 1986) qui permettent l'interruption planifiée des processus biologiques et la destruction des macrostructures de manière à faciliter leur élimination.

De nombreux signaux tant physiologiques que pathologiques, extracellulaires ou intracellulaires (drogues cytotoxiques, déprivation en facteur de croissance, TNF- a, FasL, p5X...), sont capables d'induire l'apoptose de nombreux types cellulaires. D'une manière générale, l'apoptose est considérée comme un mécanisme majeur impliqué dans des processus tant physiologiques que pathologiques. Ainsi, ce phénomène de mort cellulaire intervient dans l'élimination des cellules âgées ou endommagées et dans la dégénérescence des cellules surnuméraires, en particulier lors du développement embryonnaire. A ce titre, l'apoptose est impliquée dans les phénomènes de vieillissement cellulaire, dans le fonctionnement et l'homéostasie du système immunitaire, le renouvellement tissulaire et le développement du système nerveux. Une résistance accrue à l'apoptose entraîne l'apparition de pathologies telles que les maladies auto-immunes ou le cancer. A l'inverse, un accroissement des taux d'apoptose participe à l'émergence de maladies telles que les maladies neurodégénératives.

.II Mécanisme de l'apoptose
Dans un premier temps, les cellules en apoptose vont s'isoler des autres cellules (perte des contacts intercellulaires).

La mitochondrie de la cellule apoptotique va subir plusieurs modifications majeures : relargage du cytochrome c dans le cytoplasme (Kluck et al., 1997 ; Yang et al., 1997), diminution du potentiel membranaire Dm et modification de la perméabilité mitochondriale (Marchetti et al., 1996 ; Zamzami et al., 1996 ; Vander Heiden et al., 1997). La reconnaissance des corps apoptotiques par les phagocytes est facilitée par la translocation des phosphatidylsérines au niveau du feuillet externe de la membrane plasmique.

L'un des points morphologiques caractéristiques de l'apoptose est l'importante condensation à la fois du noyau (et de sa chromatine) et du cytoplasme ce qui induit une diminution significative du volume cellulaire. La chromatine est clivée en fragments réguliers de taille multiples de 180 paires de bases (pdb) (Wyllie et al., 1980 et 1984) sous l'action d'endonucléases donnant un profil caractéristique dit en 'barreaux d'échelle'.

La membrane cellulaire, bien que conservant son intégrité, commence à bourgeonner. Finalement, toute la cellule se fragmente en vésicules entourées d'une membrane renfermant une partie du cytoplasme de la cellule: les corps apoptotiques. Ceux-ci sont rapidement phagocytés par les cellules voisines évitant ainsi toute possibilité d'inflammation locale, contrairement à ce qui s'observe dans la mort cellulaire par nécrose. Ce processus permet d'éviter toute libération du contenu cellulaire et de prévenir ainsi d'éventuelles lésions des cellules voisines.

L'apoptose joue un rôle déterminant au cours de processus physiologiques aussi différents que le développement, et le contrôle du renouvellement cellulaire et tissulaire. La régulation de l'apoptose est également fondamentale pour l'homéostasie du système hématopoïétique et du système immunitaire car elle permet de contrôler étroitement la taille des sous-populations cellulaires.

.III Effecteurs de l'apoptose
De nombreux signaux très différents, physiologiques comme pathologiques, intra comme extracellulaires ont été identifiés comme pouvant déclencher l'apoptose. Ainsi, l'apoptose peut être induite par la carence en facteurs de croissance (NGF, IL-2...), par certains récepteurs membranaires (Fas, TNF) lorsqu'ils sont liés à leurs ligands, ou par des lésions cellulaires (radiations ionisantes, agents cytotoxiques, chocs osmotiques, hyperthermie). Ces signaux doivent alors être intégrés par la cellule qui, en fonction de son degré de différenciation et d'activation, va orienter sa réponse soit vers la mort, soit vers la survie, la prolifération ou la différenciation. Cette intégration fait appel à un certain nombre de médiateurs intracellulaires qui sont soit anti- soit pro-apoptotiques, soit les deux, selon le contexte cellulaire.

.III.1 Aspects moléculaires de l'apoptose
La mort cellulaire par apoptose résulte de l'intervention d'une machinerie spécialisée, conservée dans les espèces, et responsable de modifications morphologiques comparables, quel que soit l'agent inducteur. Ce caractère conservé a permis, par des études génétiques réalisées chez le nématode Caenorhabditis elegans, d'identifier quatre gènes centraux impliqués dans la régulation de l'apoptose au cours du développement de ce nématode. Parmi ces gènes, ced-4 et ced-3 (Caenorhabditis elegans death) sont requis pour l'initiation et l'exécution de l'apoptose. Le gène ced-9 agit en amont des gènes ced-4 et ced-3 et inhibe leurs activités proapoptotiques. Le gène egl-1 (egg-laying defective) agit en amont des gènes ced-9, ced-4 et ced-3 et régule négativement l'activité de ced-9 (Metzstein et al., 1998).

Des analyses fonctionnelles des interactions des produits de ces gènes ont permis de définir un modèle d'activation de l'apoptose chez C. elegans. Dans ce modèle, la protéine Ced-3 est la protéine effectrice de l'apoptose. La protéine Ced-4 interagit avec Ced-3 et permet l'activation de Ced-3 et l'initiation de l'apoptose. L'activation de Ced-3 par Ced-4 est inhibée par la protéine Ced-9 qui séquestre Ced-4 et/ou le complexe Ced-4/Ced-3 au niveau des membranes intracellulaires. Suite à un stimulus de mort cellulaire, la protéine Egl-1 interagit avec Ced-9, permettant ainsi l'activation de la protéase Ced-3 par Ced-4 dans le cytoplasme (Metzstein et al., 1998).

Les homologues des gènes ced-3, ced-4, ced-9 et egl-1 ont été identifiés chez les mammifères ce qui suggère que certains des mécanismes fondamentaux de la mort cellulaire programmée ont été conservés au cours de l'évolution (figure 1). La protéine Ced-3 appartient à la famille des protéases à cystéine ou caspases, dont on connaît actuellement 14 membres. Ced-9 et Egl-1 présentent des homologies avec le proto-oncogène Bcl-2 qui est le premier membre identifié d'une grande famille de protéines régulatrices de l'apoptose. Ced-4 enfin est l'homologue de Apaf-1 (apoptosis activating factor), et Flash / Nod-1 / Card-4 (Zou et al., 1997 ; Bertin et al., 1999 ; Imai et al., 1999 ; Inohara et al., 1999). L'activation de la caspase-9 par Apaf-1 est régulée négativement ou positivement par les différents membres de la famille des Ced-9/Egl-1/Bcl (Li et al., 1997 ; Hu et al., 1998 ; Luo et al., 1998 ; Pan et al., 1998). Si le schéma général d'activation de l'apoptose est conservé entre nématodes et mammifères, la multiplicité des gènes impliqués dans l'apoptose chez les mammifères augmente le niveau de complexité des mécanismes de régulation de la mort cellulaire programmée chez les organismes supérieurs.




Figure 1 : Gènes impliqués dans l'apoptose chez C. Elegans et chez les mammifères (d'après Couzinet et al., 2002).

.III.2 Rôle mitochondrial
La mitochondrie, depuis longtemps identifiée comme l'organite indispensable à la production d'ATP, a été également impliquée dans la régulation des mécanismes moléculaires de mort cellulaire. En effet, dans une cellule engagée dans un processus de mort cellulaire (à la suite de stimuli engendrant un stress ou un dommage cellulaire, que ce soit à la suite d'un choc thermique ou osmotique, de radiations ionisantes, ou d'un sevrage en cytokines), on observe une perméabilisation des membranes mitochondriales (à l'origine de la libération de protéines pro-apoptotiques de l'espace inter-membranaire vers le cytosol) accompagnée dans la plupart des cas d'une chute du potentiel transmembranaire mitochondrial (DYm). Le mécanisme précis de cette perméabilisation membranaire reste encore controversé.

Les protéines mitochondriales libérées par cette perméabilisation sont maintenant regroupées sous le nom générique de SIMP (pour « soluble inter membrane mitochondrial proteins ») et possèdent toutes une activité pro-apoptotique. Une première classe de SIMP agit sur la voie classique d'apoptose dépendante des caspases. On y distingue des pro-caspases, le cytochrome c et un répresseur d'inhibiteur de caspases, la protéine Smac/DIABLO. Une fois libéré dans le cytosol, le cytochrome c interagit avec la protéine Apaf-1 et la pro-caspase 9, formant ainsi, en présence d'ATP, un complexe multiprotéique appelé apoptosome à l'origine du clivage de la pro-caspase-9, et donc de la formation de sa forme active (Zou et al., 1999). Cette dernière activera à son tour d'autres caspases exécutrices comme les caspases 3 ou 7. La protéine Smac/DIABLO, quant à elle, se lie aux protéines inhibitrices de l'apoptose (IAP) et les inactive.

Le facteur inducteur de l'apoptose (AIF pour « apoptosis inducing factor ») est, pour l'instant, le seul représentant d'une autre classe de SIMP : il s'agit d'une flavoprotéine qui déclenche, d'une manière indépendante des caspases, la fragmentation de la chromatine en particules de haut poids moléculaire (Susin et al., 1999).

Les membres de la famille Bcl-2 ont une importance cruciale dans la régulation des voies de signalisation de la mort cellulaire. Cette famille comprend aussi bien des protéines pro-apoptotiques (comme Bax, Bak, Bad, Bid, Bim) qu'anti-apoptotiques (comme Bcl-2 et Bcl-xL). L'alignement de leurs séquences protéiques a permis de définir quatre régions de forte conservation appelées domaines BH (pour « Bcl-2 homology ») 1 à 4. Certaines molécules pro-apoptotiques contiennent les domaines BH1, BH2 et BH3 (Bak), tandis que d'autres ne contiennent que le domaine BH3 (Bid, Bim, Bad). Le domaine BH4 est quant à lui spécifique des protéines anti-apoptotiques (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-l, A1, Diva). Ces protéines interagissent entre elles formant des homodimères ou des hétérodimères, le niveau relatif de chaque protéine dans la cellule déterminant sa sensibilité à un signal de mort (Adams et al., 1998).

Par ailleurs, une grande majorité d'entre elles contiennent une partie carboxy-terminale hydrophobe qui assure leur ancrage au niveau de la membrane externe mitochondriale, mais également des membranes externes du réticulum endoplasmique et du noyau. Les molécules anti-apoptotiques seraient localisées dans la mitochondrie tandis que les protéines pro-apoptotiques posséderaient une localisation différente (cytosol ou microtubules). À la suite d'un signal apoptotique, ces dernières s'inséreraient dans la membrane mitochondriale et induiraient sa perméabilisation (Crompton et al., 2000). Il a été proposé que cette capacité d'insertion soit liée à leur similitude de structure avec certaines toxines bactériennes, leur permettant de former des pores transmembranaires modulant ainsi la libération des SIMP (Schendel et al., 1998).

.III.3 Rôle des caspases
.III.3.1 Structure des caspases
En dépit de la diversité de ces signaux, toutes les cellules engagées dans le processus apoptotique montrent des modifications morphologiques et biochimiques similaires suggérant l'existence d'une phase effectrice commune à tous les types cellulaires. Cette signalisation aboutit alors à l'activation irréversible de molécules effectrices. Parmi les principaux effecteurs contribuant à la destruction de la cellule, on distingue d'une part les protéases à cystéine, également appelées caspases (pour cysteinyl aspartate-specific proteinases) ; et d'autre part les nucléases.

La première protéase à cystéine identifiée chez les mammifères a été ICE (pour interleukin-1 b converting enzyme) plus tard renommée caspase-1. Les cibles des caspases sont des protéines dont la dégradation aboutit soit à la perte de leur fonction, soit à l'acquisition de nouvelles activités enzymatiques.

On connaît maintenant 14 caspases différentes. L'ensemble des membres de cette famille d'endoprotéases possède un site catalytique comprenant un résidu cystéine directement impliqué dans le processus catalytique localisé dans un motif QACxG (où le résidu x est R, Q ou G). Ces enzymes reconnaissent, puis clivent des chaînes polypeptidiques au niveau d'un résidu aspartique de la partie carboxy-terminale.

Les caspases sont présentes dans le cytoplasme sous une forme inactive (zymogène). Comme elles clivent spécifiquement leurs substrats au niveau d'un résidu Asp, elles ont la capacité de s'autoactiver et/ou de s'activer mutuellement, ce qui aboutit à une activation protéolytique en cascade. Leur protéolyse provoque la dimérisation des formes zymogènes conduisant à leur clivage. Un premier clivage libère une première sous-unité (p10/p12), tandis qu'un second clivage engendrera une sous-unité de taille plus importante portant le site catalytique (p17/p20). L'enzyme ainsi formée par l'association des deux sous-unités est composée de deux hétérodimères qui comprennent chacun deux sites catalytiques actifs (Budihardjo et al., 1999) (figure 2).

.III.3.2 Mécanisme d'action des caspases
En plus de leurs sous-unités actives, les pro-caspases possèdent un pro-domaine de longueur variable à leur extrémité NH2-terminale qui permet de les diviser en deux sous-groupes.

Les caspases à long pro-domaine, dites caspases d'amont ou initiatrices, contiennent des motifs d'interaction protéine-protéine, tels que les domaines DED (« death effector domain ») pour les caspases 8 et 10 ou CARD (« caspase recruitement domain ») pour les caspases 1, 2, 4 et 9. Ces domaines permettent leur recrutement par des protéines adaptatrices au niveau de complexes protéiques d'initiation de l'apoptose. Le recrutement des pro-caspases initiatrices au niveau de ces sites spécifiques entraîne l'oligomérisation des proenzymes et leur activation par autocatalyse (Kumar and Colussi, 1999).

Les caspases 3, 6, 7 et 14 possèdent quant à elles un pro-domaine plus court (10 à 40 résidus) et sont dites caspases d'aval. Elles ne possèdent pas de domaine leur permettant d'être recrutées et de s'oligomériser ; elles sont activées à la suite de leur clivage par une autre caspase (à pro-domaine court ou long) ou par le granzyme B, ce qui aboutit à un fonctionnement dit en cascade. Leur activation conduit au clivage de diverses protéines substrats (Thornberry et al., 1998) à l'origine de la plupart des événements biochimiques, structuraux ou morphologiques de l'apoptose.

De nombreux substrats des caspases ont, à ce jour, été identifiés. Le premier substrat identifié est l'enzyme poly-ADP-ribose-polymérase (PARP) dont la coupure, au niveau de la séquence DEVD-G, est l'un des premiers signes détectables de l'apoptose. Le clivage protéolytique a pour conséquences, soit l'activation de protéines impliquées dans le déroulement de l'apoptose (procaspases, endonucléases, PKC-d, facteurs de transcription SREBP-1,-2), soit l'inactivation de protéines contribuant au maintien de l'intégrité cellulaire (actine, lamines nucléaires, fodrine, facteur ICAD/DFF45 ) ou à la régulation de la réparation de l'ADN (PARP, DNA-PK) ou du cycle cellulaire (RB).




Figure 2 : Activation en cascade des caspases (d'après Couzinet et al., 2002).

.III.4 Les récepteurs de mort cellulaire
Les membres de la famille du TNF-R sont des protéines transmembranaires de type 1 possédant dans leur domaine extracellulaire de une à six régions riches en cystéines, impliquées dans la liaison du ligand. Ils peuvent promouvoir, selon le contexte cellulaire, soit la survie, soit la mort soit les deux. Ainsi, les récepteurs CD27 (Camerini et al., 1991), CD30 (Durkop et al., 1992), CD40 (Stamenkovic et al., 1989), TNF-RII (Smith et al., 1990), Ox40 (Mallett et al., 1990), et p75 NGFR (pour « nerve growth factor receptor ») (Johnson et al., 1986) sont généralement impliqués dans la survie cellulaire. A l'inverse, CD95 (Fas/APO-1) (Itoh et al., 1991 ; Oehm et al., 1992), TNF-RI (Loetscher et al., 1990 ; Schall et al., 1990), DR3 (Chinnaiyan et al., 1996), DR4 (Chaudhary et al., 1997), DR5 (Chaudhary et al., 1997) et DR6 (Pan et al., 1998) sont généralement impliqués dans la mort cellulaire.

Certains des membres de la superfamille des récepteurs au TNF, connus sous le nom de « récepteurs de mort », possèdent dans leur portion intracellulaire une région conservée appelée le « domaine de mort » (DD), un motif protéique d'environ 80 acides aminés nécessaire à la transmission du signal de mort par ces récepteurs (Tartaglia et al., 1993 ; Chaudhary et al., 1997 ; Nagata et al., 1997). On connaît actuellement 7 de ces récepteurs: Fas (CD95/APO-1), TNFR1 (p55/CD120a), DR3, DR6, p75 NGFR, ainsi que les deux récepteurs du ligand de Apo-2 ou TRAIL (pour « TNF-related apoptosis-inducing ligand »), les molécules DR4 (TRAIL-R1) et DR5 (TRAIL-R2) (Locksley et al., 2001). La capacité d'induction de mort cellulaire relayée par le récepteur Fas est parmi toutes ces voies de signalisation la plus étudiée et décrite. Il est à noter que récemment une nouvelle nomenclature a été proposée pour classer les récepteurs et les ligands de la superfamille du TNF (figure 3).




Figure 3 : Nouvelle nomenclature des récepteurs et des ligands de la superfamille du TNF

De façon générale, les voies de signalisation apoptotique des récepteurs de mort de la famille du récepteur au TNF conduisent à l'activation des caspases et en sont directement dépendantes (Enari et al., 1995 ; Longthorne et Williams, 1997). Les récepteurs de mort sont activés par la fixation de leur ligand et vont recruter des protéines intracellulaires dites adaptatrices. Ces protéines vont alors à leur tour recruter les caspases initiatrices (principalement la 8 et la 10) et induire leur activation par auto-clivage. De ce fait, il semble que la voie de Fas qui est décrite dans le chapitre suivant corresponde au processus généralement observé.

Il est à noter cependant l'existence d'un autre sous-groupe de récepteurs homologues au récepteur au TNF : les decoy récepteurs (DcR). On distingue actuellement le DcR1 (Sheridan et al., 1997) et le DcR2 (Marsters et al., 1997) qui sont des récepteurs membranaires ; et le DcR3 (Pitti et al., 1998) qui est une protéine soluble secrétée (figure 4). Ces récepteurs auraient un rôle d'inhibiteur des récepteurs de mort plutôt qu'un rôle de transduction d'un signal. En effet, les domaines extracellulaires de DcR1 et DcR2 sont tous les deux capables de fixer TRAIL et sont ainsi en compétition avec DR4 et DR5. Cependant, DcR1 ne possède pas de région cytoplasmique, et celle de DcR2, plus courte qu'un domaine de mort typique, ne permet pas la transmission d'un signal apoptotique. DcR3 présente 4 domaines riches en cystéine et est une protéine soluble qui peut se fixer à FasL avec la même affinité que Fas. De ce fait, DcR3 inhiberait, par compétition de fixation avec Fas, l'apoptose induite par FasL mais son rôle physiologique n'est pas encore clairement établi.




Figure 4 : Voies de signalisation apoptotique des récepteurs de mort et de leurs ligands (d'après Ashkenazi et al., 1999).

.III.5 Inhibiteurs de l'apoptose
Les virus ont développé diverses stratégies très efficaces afin d'inhiber la mort cellulaire et la libération de cytokines pro-inflammatoires par les cellules infectées dans le but d'achever son cycle de réplication et ainsi d'infecter de nouvelles cellules. À ce jour, de nombreuses molécules virales, mais aussi cellulaires animales et même végétales (Thatte et al., 2000), ont été décrites comme ayant une activité inhibitrice de l'apoptose.

.III.5.1 Les protéines FLIP
Les récepteurs de mort décrits précédemment vont, après leur activation, recruter des protéines adaptatrices qui vont à leur tour activer les caspases initiatrices. Cette étape de recrutement peut être régulée par une protéine appelée FLIP (pour « FLICE inhibitory protein ») (Irmler et al., 1997). FLIP contient deux domaines effecteurs de mort cellulaire (DED) qui vont lui permettre de se lier aux pro-domaines des caspases-8 ou -10 et ainsi empêcher leur recrutement aux récepteurs de mort (notamment Fas et TNF-RI) (Bump et al., 1995). Cette famille d'inhibiteurs de caspases a été identifiée à l'origine chez le virus de l'herpès et le virus molluscipox (Bertin et al., 1997 ; Thome et al., 1997). Il existe une grande variété de transcrits de FLIP (Komiyama et al., 1994). Le transcrit le plus long (FLIPL) possède, en plus des deux DEDs, l'équivalent d'un domaine caspase inactif. La forme courte (FLIPS), pour sa part, ne présente que les deux DEDs. FLIP a été décrit comme pouvant protéger de l'apoptose (Hu et al., 1997 ; Irmler et al., 1997 ; Srinivasula et al., 1997 ; Rasper et al., 1998) ou induire l'apoptose (Han D.K. et al., 1997 ; Inohara et al., 1997 ; Shu et al., 1997) selon la nature du transcrit et le type cellulaire considéré. Cependant, dans des conditions physiologiques, FLIP semble fonctionner comme un inhibiteur de la pro-caspase-8. Ainsi, il a été montré que la sensibilité des cellules T à l'apoptose induite par Fas était corrélée avec la diminution du taux d'ARN messager de FLIP (Thome et al., 2001 ; Lens et al., 2002).

En définitive, il apparaît que le rôle de FLIP dans la modulation de l'apoptose semble très complexe. Son effet semble dépendre de la nature du transcrit, du type cellulaire considéré, ainsi que du niveau d'expression de chacune des isoformes mais son effet généralement reconnu est celui d'inhibiteur de la caspase-8.

.III.5.2 Protéine de la famille de Bcl-2
Comme cela a été décrit précédemment dans le rôle apoptotique de la mitochondrie, la grande famille des protéines homologues à Bcl-2 joue un rôle majeur dans la régulation de l'apoptose. Cette régulation passe principalement par la modulation de la voie apoptotique mitochondriale et des caspases associées, notamment la caspase-9. Ainsi, en empêchant la libération du cytochrome c par la mitochondrie, Bcl-2 et Bcl-XL inhibent la formation du complexe Apaf-1/cytochrome c/caspase-9 qui est nécessaire à l'apoptose.

.III.5.3 Les protéines inhibitrices de l'apoptose (IAP)
Les baculovirus possèdent une autre protéine capable d'inhiber l'apoptose : IAP (pour inhibitor of apoptosis protein). Au moins 5 homologues ont été identifiés chez les mammifères. La protéine inhibitrice de l'apopotose neuronale (NAIP) est un de ces homologues et joue un rôle important dans l'atrophie musculaire spinale (Liston et al., 1996) ou son gène serait en partie délété chez les malades atteints d'atrophie musculaire spinale de type I. Les homologues cIAP-1 (Roy et al., 1997) [aussi appelé hIAP-2 (Liston et al., 1996] ; cIAP-2 (Rothe et al., 1995) [également nommé hIAP-1 (Liston et al., 1996)] et XIAP (pour IAP lié au chromosome X) (Rajcan-Separovic et al., 1996) inhibent les caspases de façon similaire mais par un processus distinct de celui de NAIP. Enfin, la survivine est largement exprimée au cours de la vie embryonnaire mais absente des tissus différenciés. Son expression va être retrouvée dans les lignées tumorales et les cancers les plus courants, ainsi que dans 50% des lymphomes de Hodgkin (Ambrosini et al., 1997).

L'effet protecteur des IAPs est dû à leur capacité à inhiber l'activation et donc l'activité de certaines caspases. Ainsi, XIAP, cIAP-1 et cIAP-2 inhibent les caspases 3, 7 et 9 mais pas les caspases 1, 6 et 8 (Deveraux et al., 1997 ; Roy et al., 1997 ; Deveraux et al., 1998). NAIP, pour sa part, est incapable d'inhiber les caspases 1, 3, 6, 7 ou 8 (Roy et al., 1997).

Les IAP, à l'exception de la survivine, sont caractérisées par 3 domaines BIRs (« baculovirus IAP repeats ») dans leur partie N-terminale et un domaine d'interaction protéine-protéine contenant un atome de zinc (RING finger) dans leur partie C-terminale. La survivine ne contient que les domaines BIRs. Différentes études ont montré que seul BIR2 était requis pour inhiber les caspases 3 et 7 et que le domaine RING n'était pas nécessaire (Deveraux et al., 1997 ; Takahashi et al., 1998). De plus, il semble que cIAP-1 et cIAP-2 puissent se lier à TRAF-1 et 2 (TNF-R associated factors) grâce à leur motif BIR (Rothe et al., 1995 ; Roy et al., 1997). Ces travaux montrent que les IAP, tant cellulaires que viraux, exercent des effets inhibiteurs sur l'activation des caspases en aval des récepteurs de mort (Wang C.Y. et al., 1998 ; Vucic et al., 1998).

Tout dernièrement, une nouvelle protéine nommée selon les auteurs Diablo (Verhagen et al., 2000) ou Smac (Du et al., 2000) a été décrite. Cette protéine, une fois synthétisée est importée dans la mitochondrie. Au cours de l'apoptose, Diablo/Smac est libérée et se lie aux IAPs empêchant leur action protectrice et permettant ainsi aux caspases contenues dans l'apoptosome de s'activer.

.III.5.4 Rôle des phosphorylations
De nombreuses études ont rapporté que l'apoptose pouvait être régulée par des protéines kinases et des protéines phosphatases (Anderson, 1997 ; Downward, 1998 ; Martins et al., 1998). L'étude de Martins et al. en 1998 indique que les caspases peuvent être phosphorylées in vivo. De plus, un marquage métabolique de cellules au phosphate radiomarqué suivi d'un stimulus pro-apoptotique a révélé que plusieurs caspases contenaient un radioélément (Martins et al., 1998). La même étude a montré que la déphosphorylation des caspases était corrélée à une augmentation de leur capacité à cliver la PARP, impliquant la possibilité que la phosphorylation puisse inhiber le clivage de certains substrats par ces protéases. Enfin, la kinase Akt, qui joue un rôle important dans le système nerveux dans la cascade des kinases induites par les récepteurs aux neurotrophines (Yuan et al., 2000) peut phosphoryler spécifiquement la pro-caspase-9 humaine et ainsi inhiber son activation (Cardone et al., 1998).

Deuxième partie : LE RECEPTEUR FAS
.I Structure de la protéine Fas
Comme cela a été précédemment évoqué, Fas appartient à la superfamille des récepteurs au TNF / NGF qui est caractérisée par la présence de 2 à 5 domaines riches en cystéine situés dans la partie extracellulaire du récepteur. Dans cette famille, Fas (également appelé CD95 ou Apo1) est le mieux décrit des récepteurs de mort, qui sont également caractérisés par la présence d'un domaine DD intracellulaire crucial dans l'induction du signal pro-apoptotique.

Fas est une protéine de 335 acides aminés (a.a.) et d'un poids moléculaire variant de 45 à 52 Kda (Oehm et al., 1992) suivant les études, probablement en raison de différences de glycosylation du récepteur (Keppler et al., 1999). De plus, des formes solubles du récepteur, générées par un épissage alternatif au niveau du domaine transmembranaire, ont été décrites et contribuent à la régulation de l'apoptose induite par FasL (Cheng et al., 1994 ; Papoff et al, 1999).

.I.1 Partie extracellulaire
La partie extracellulaire du récepteur Fas comprend les 156 premiers a.a. de l'extrémité N-terminale. Elle est caractérisée par la présence de 3 domaines riches en cystéine (CRD pour « cystein-rich domain ») qui vont des a.a. 28 à 65 pour CRD1 ; de 65 à 112 pour CRD2 et enfin de 112 à 149 pour CRD3. Des travaux récents, réalisés à partir de récepteur Fas tronqué dans la partie extracellulaire, ont mis en évidence que les deux domaines les plus proches de la partie trans-membranaire correspondaient à la zone de fixation du ligand de Fas ou LBD (pour « ligand binding domain »). Plus récemment, le troisième domaine a été identifié comme étant la zone d'oligomérisation indépendante du ligand du récepteur, qui est indispensable dans la transduction du signal apoptotique de Fas (Papoff et al., 1999). Cette oligomérisation indépendante du ligand est liée à la présence d'un domaine d'auto-association indépendante du ligand ou « PLAD » (pour « pre-ligand association domain ») qui va des a.a. 1 jusqu'à 65 du récepteur Fas (Siegel at al., 2000) (figure 5).

.I.2 Partie intra-cellulaire
La partie intra-cellulaire de Fas ne contient aucune séquence consensus qui pourrait prédire la présence d'une activité enzymatique (Sartorius et al., 2001). Les 15 a.a. de la partie C-terminale de Fas servent de zone d'interaction avec la protéine tyrosine phosphatase FAP-1 (pour « Fas-associated phosphatase ») , et leur délétion entraîne une augmentation de l'apoptose transmise par Fas (Sato et al., 1995). Tartaglia et al. ont défini en 1993 par délétion et mutagénèse dirigée une région de 80 a.a. au niveau du TNF-R1 indispensable à la transmission du signal de mort cellulaire. Itoh et al. (1993) ont montré qu'une zone de 68 a.a. hautement conservée entre Fas et le TNF-R1 correspond au domaine de mort de Fas (figure 5). Ce domaine comprend notamment le résidu Valine 238 dont la mutation chez les souris lprcg abolit le signal apoptotique.

De plus, un site de phosphorylation a été mis en évidence en dehors du DD, au niveau de la zone proximale avec la membrane plasmique (Kennedy et al., 1998).




Figure 5 : Domaines protéiques du récepteur Fas.

.II Voies de l'apoptose induite par Fas
.II.1 Initiation du signal
Jusqu'à présent, il avait été supposé que le ligand de Fas sous forme homotrimérique (composé de trois monomères identiques) ou un anticorps anti-Fas agoniste engageaient trois monomères de Fas, conduisant ainsi à l'assemblage d'un récepteur trimérique et à l'agrégation des domaines de mort sous la membrane (Orlinick et al., 1997).

Des travaux récents ont mis en évidence que non seulement Fas possédait la capacité de s'assembler en trimères indépendamment de l'engagement de son ligand, mais que ce pré-assemblage des monomères en trimères était un prérequis à la liaison de FasL et donc à la transmission du signal de mort (Papoff et al., 1999 ; Siegel et al., 2000). La région nécessaire à cette trimérisation de Fas appelée PLAD est constituée des 49 premiers acides aminés de la région amino-terminale de la portion extracellulaire de Fas et est donc distincte du domaine de liaison à Fas-L. Ainsi, indépendamment de la présence d'un ligand, des trimères et des monomères de Fas co-existent dans la membrane plasmique.

.II.2 Transduction du signal
.II.2.1 Voies apoptotiques
.II.2.1.1 Formation du complexe de signalisation de mort induite (DISC)
Comme Fas ne contient aucune activité enzymatique propre, le signal de mort doit être transmis par l'intermédiaire de protéines qui s'associent au récepteur après sa stimulation. La transmission du signal apoptotique de Fas passe par la formation d'un complexe multiprotéique formé par l'agrégation des récepteurs Fas, la protéine FADD ( pour « Fas-associated death domain ») et la caspase-8. Ce complexe est nommé « complexe de signalisation de la mort induite » ou DISC (pour death inducing signaling complex).

En 1995, Kischkel et al. ont identifié la protéine nommée FADD qui se fixe à Fas après stimulation par son ligand ou un anticorps agoniste. FADD possède un domaine de mort homologue à celui de Fas qui permet son association avec celui-ci (Boldin et al., 1995 ; Chinnaiyan et al., 1995). A son autre extrémité (N-terminale), FADD possède un domaine effecteur de mort ou DED (pour « death effector domain ») qui est indispensable au recrutement et à l'activation de la caspase-8 et, de ce fait, une protéine FADD possédant son domaine DD mais tronquée dans son domaine DED ne peut induire l'activation de l'apoptose (Chinnaiyan et al., 1996).

Les travaux de Muzio et al. (1996) ont montré la présence des formes zymogènes et activées de la caspase-8 dans le DISC, reliant ainsi directement le récepteur Fas à la cascade des caspases. Après activation du récepteur Fas, FADD et la pro-caspase-8 sont recrutés et la formation d'oligomères de pro-caspase-8 suffit à activer son auto-protéolyse qui libère ainsi la sous-unité catalytique de la caspase-8 dans le cytoplasme (Martin et al., 1998 ; Salvesen et al., 1999).

La caspase-8 va alors activer par clivage la caspase-3 qui va initier une cascade de caspases effectrices qui vont conduire de façon inéluctable à la mort apoptotique de la cellule (Slee et al., 1999). Il est à noter que la caspase-8 est essentielle à la mort celllulaire induite par Fas (Varfolomeev et al., 1998).

Les travaux récents de Algeciras-Schimmich et al. (2002) ont permis de mieux définir l'ordre de la signalisation initiale de la voie de Fas. Ainsi, il a été montré que la fixation de FasL induit la formation de microagrégats de Fas. Ceci permet alors la formation du DISC selon un processus faisant intervenir les filaments d'actine et l'activation de la caspase-8 mais avec trop peu d'efficacité pour la transduction d'un signal apoptotique. Cependant, la formation de caspase-8 activée permet la formation à la surface cellulaire de larges regroupements membranaires de protéines Fas. Il est à noter que ce regroupement du récepteur fait également intervenir la voie des sphyngomyélinases sur laquelle nous reviendrons ultérieurement (Gulbins et al., 2002). Ces regroupements membranaires de récepteurs Fas vont permettre d'augmenter le signal transmis et l'activation de la caspase-8 pour induire le signal apoptotique. Le complexe Fas / FasL serait alors internalisé, grâce à la formation de vésicules d'endocytose par un processus encore mal défini (figure 6).




Figure 6 : Modélisation du signal initial de l'activation de la voie Fas (d'après Algeciras-Schimmich et al., 2002).

.II.2.1.2 Rôle de la voie mitochondriale : cellules de type I et de type II
L'importance de la voie mitochondriale a été récemment démontrée dans la mort induite par Fas au moins dans certaines cellules (Fulda et al., 1998). En fait, selon l'utilisation de l'une de ces voies apoptotiques en aval de Fas, deux types de cellules ont pu être définies (Scaffidi et al., 1998) (figure 7).

Les cellules de type I seraient indépendantes d'une activité apoptotique des mitochondries et utiliseraient uniquement une activité directe des caspases telle que décrite précédemment.

Les cellules de type II seraient dépendantes de l'activation de la voie apoptotique mitochondriale. Mis à part la quantité de pro-caspase-8 recrutées et clivées au niveau du DISC (faible dans les cellules de type II et importante dans les cellules de type I), aucune différence moléculaire n'a permis à ce jour d'expliquer cette différence d'activation entre les deux types de cellules.

Un membre de la famille de Bcl-2, la molécule Bid (Luo et al., 1998), constitue un des liens entre la voie du récepteur Fas et la voie mitochondriale (Li et al., 1998). Un fragment de la protéine Bid, issu du clivage par la caspase 8, est transféré du cytoplasme à la mitochondrie. En effet, Bid, en se liant à Bax, un autre membre pro-apoptotique de la famille Bcl-2 présent sous forme monomérique dans le cytosol, induit l'oligomérisation de ce dernier et son intégration dans la membrane externe mitochondriale, entraînant l'ouverture de mégapores mitochondriaux à l'origine de la chute du potentiel transmembranaire mitochondrial et de la libération du cytochrome c (Eskes et al., 2000). Une autre protéine faisant la jonction entre les deux voies a été identifiée. Il s'agit de la protéine régulatrice BAR pour « bifunctional apoptosis regulator » (Zhang et al., 2000), qui possède la capacité de s'associer à la fois aux molécules anti-apoptotiques Bcl-2/Bcl-xL (via un domaine d'interaction protéine-protéine SAM pour « sterile-alpha motif ») et à la caspase-8 (via un domaine DED-like).

De ce fait, le rôle inhibiteur de Bcl-2 dans la mort induite par Fas dépend directement de l'identification des cellules de type I ou de type II. En effet, Bcl-2 ne jouerait aucun rôle dans la mort provoquée par Fas dans les cellules au sein desquelles une activation directe des caspases est suffisante (type I). En revanche, dans des cellules pour lesquelles une amplification du signal d'activation via la voie mitochondriale (type II) est nécessaire, la mort induite par Fas serait modulée par des protéines de la famille Bcl-2.




Figure 7 : Voies d'activation de Fas dans les cellules de type I ou de type II (d'après Couzinet et al., 2002).

.II.2.2 Voie proliférative
Paradoxalement, il a aussi été montré que l'activation du récepteur Fas déclenche la prolifération de cellules T stimulées par leur TCR et des thymocytes humains purifiés (Alderson et al., 1993). De plus, la seule stimulation de Fas est suffisante pour induire significativement la prolifération de fibroblastes humains de peau (Freiberg et al., 1997 ; Jelaska et al., 1998). De même, FasL peut induire l'activation de ERK1/2, un activateur moléculaire de prolifération, sur des fibroblastes en privation de sérum (Ahn et al., 2001). Néanmoins, selon les conditions utilisées, l'activation de Fas peut aussi induire l'apoptose des fibroblastes (Freiberg et al., 1997 ; Jelaska et al., 1998). Les voies de signalisation qui conduisent de la stimulation de Fas à la prolifération des fibroblastes sont actuellement complètement inconnues.

Cependant, la prolifération des cellules T humaines purifiées activées par la co-stimulation de Fas semble impliquer l'activation de caspases sans induire l'apoptose (Miossec et al., 1997 ; Wilhelm et al., 1998 ; Alam et al., 1999 ; Kennedy et al., 1999). L'activation de caspases dans des cellules T polyclonales stimulées a été fonctionnellement reliée à la prolifération induite par le TCR car celle-ci est bloquée en présence d'inhibiteurs à large spectre des caspases (Kennedy et al., 1999 ; Alam et al., 1999). La stimulation du TCR, entre autres conséquences, induit l'augmentation de l'expression de FasL (Nagata et al., 1995). Ceci et le rôle de co-stimulation de FasL dans l'activation des cellules T suggèrent la possibilité d'une boucle autocrine d'activation de FasL et de Fas, médiée par le TCR, qui déclenche une voie de signalisation non-apoptotique, caspase-dépendante, et indispensable à la prolifération des cellules T (Kennedy et al., 1999).

De plus, le Fas-Fc (un antagoniste de Fas) bloque la prolifération des cellules T stimulées par des quantités suboptimales d'anticorps d'anti-TCR bien que ceci ne soit pas observé avec de fortes concentrations d'anticorps anti-TCR, suggérant que d'autres récepteurs de mort tels que TRAIL-R1, TRAIL-R2, DR3 ou DR6 peuvent se substituer à la voie de Fas (Kennedy et al., 1999). Ceci pourrait également expliquer pourquoi ce défaut de prolifération des cellules T n'affecte pas les souris lpr (déficientes en Fas) (Watanabe-Fukunaga et al., 1992) et gld (déficientes en FasL) (Ramsdell et al., 1994).

Alors que l'activation des caspases après la stimulation du TCR a été clairement établie (Kennedy et al., 1999 ; Alam et al., 1999), des données différentes ont été rapportées concernant les caspases impliquées et leurs substrats. Kennedy et al. (1999) ont montré l'activation de la caspase-8, mais n'ont pas détecté le clivage de la caspase-3 et de son substrat, la PARP. Par opposition, Alam et al. (1999) ont montré l'activation des caspases-3, -6, -7 et -8 de même que le clivage sélectif de quelques substrats de la caspase-3 tels que la PARP. Cependant, l'ensemble de ces travaux montre que la prolifération des cellules T induite par la voie de Fas est initiée par la caspase-8, qui s'autoactive après avoir été recrutée par FADD.

.II.3 Régulateurs de la transduction du signal de Fas
.II.3.1 Fas et NFKB
La voie de signalisation du facteur nucléaire NFKB peut être activée par une grande variété de stimuli tels que les cytokines, les ultra-violets, et les produits bactériens ou viraux pour finalement activer les facteurs de transcription appartenant à la famille de protéine NFKB/Rel (Silverman et al., 2001 ; Ghosh et al., 2002 ; Karin et al., 2002).

Il a été montré que l'activation de NFKB et l'induction de l'apoptose, en particulier par les récepteurs de mort, sont liées par des boucles de rétro-contrôle inhibitrices. De ce fait, la voie de signalisation NFKB régule négativement l'apoptose induite par les récepteurs de mort en augmentant l'expression de protéines anti-apoptotiques. De plus, l'apoptose interfère avec l'activation de NFKB par l'intermédiaire des caspases qui clivent plusieurs composants de la voie de signalisation de NFKB (Wajant H et al, 2003). Ainsi, l'inhibition de l'apoptose augmente fortement l'activation de NFKB par la voie de Fas (Mandal et al., 1996 ; Wajant et al., 2000). Bien que les mécanismes exacts d'activation de NFKB par Fas demeurent mal connus, il semble qu'ils fassent intervenir la protéine FADD et la caspase-8 (Hu et al., 2000). Bien que cette voie soit masquée par la voie apoptotique de Fas, elle peut être observée lorsque cette dernière est bloquée. Ainsi, l'activation de NFKB augmente l'expression de la protéine FLIP (Kreuz et al., 2001) qui, en empêchant l'activation de la caspase-8 par FADD, est un puissant inhibiteur de la voie apoptotique de Fas. De plus, FLIP va également augmenter l'activation de NFKB (Kataoka et al., 2000) formant ainsi une boucle d'autoactivation.

.II.3.2 Fas et les protéines kinases activées par la mitose
Les cascades de protéines kinases activées par la mitose (MAPK) sont formées par 3 cascades fonctionnellement distinctes : les kinases régulées par des voies extracellulaires (ERK), la voie de la kinase p38 et la voie de la kinase terminale cJun (JNK). La voie de JNK peut être activée par divers signaux tels que les facteurs de croissance, les cytokines, l'osmolarité ou les ultra-violets. Elle va ensuite activer par phosphorylation des facteurs de transcription (tels que cJun, ATF2). La voie de signalisation de JNK a été impliquée dans la prolifération, la différenciation et dans l'induction, mais aussi la prévention de l'apoptose (Pinkoski et al., 1999 ; Davis et al., 2000 ; Shaulian et al., 2002).

La protéine Daxx (Yang et al., 1997), bien que dépourvue de DD, est capable de s'associer à celui de Fas mais dans une région distincte de celle de FADD. In vitro, Daxx potentialise l'apoptose induite par Fas, mais ne permet pas de compenser l'absence de FADD dans des lignées cellulaires dépourvues de cette dernière. La voie passant par Daxx fait intervenir la kinase ASK-1 (pour « apoptosis signal-regulating kinase-1 ») et active la cascade des kinases JNK et SAPK qui participent à la régulation de la prolifération cellulaire (Chang et al., 1998).

Dans le contexte de l'activation de la voie Fas, la voie des JNK a particulièrement été étudiée pour son effet pro-apoptotique. L'activation des JNK par la voie de Fas est régulièrement associée à l'apoptose. Cette activation des JNK par la voie de Fas est probablement transmise par les caspases (Cardone et al., 1997 ; Deak et al., 1998 ; Widmann et al., 1997 et 1998). De plus, plusieurs études ont montré que l'inhibition des caspases bloque non seulement l'apoptose, mais également l'activation des JNK (Lenczowski et al., 1997 ; Deak et al., 1998 ; Low et al., 1999 ; Sabapathy et al., 1999. Wilson et al., 1999 ; Rochat-Steiner et al, 2000). Cependant, dans la plupart des cas, l'inhibition des JNK n'a aucun effet ou seulement un effet modéré sur l'apoptose induite par Fas et l'activation des JNK n'est pas une étape obligatoire dans la mort de la cellule par la voie de Fas.

.II.3.3 Fas et Protéine Kinase C
Plusieurs études ont montré que l'activation de la protéine kinase C (PKC) peut réprimer l'apoptose cellulaire, et notamment l'apoptose induite par la voie de Fas (Gomez-Angelats et al., 2000; Herrant et al., 2002, Busuttil et al., 2002). Ainsi, Ruiz-Ruiz et al. (1997) ont montré dans la lignée lymphocytaire T Jurkat que l'activation de la PKC diminue dès les premiers stades de l'apoptose induite par la voie Fas par deux mécanismes distincts. L'un utilise la voie des MAPK et l'autre, majoritaire, est un mécanisme MAPK-indépendant (Ruiz-Ruiz et al., 1999). De plus, Gomez-Angelats (2001) a montré que la PKC module la voie de Fas en amont du recrutement de FADD et de la caspase-8 en modifiant l'efficacité de la formation du DISC.

.II.3.4 Sphingomyélinases, céramides, et regroupements membranaires du récepteur Fas
Bien que la stimulation de l'apoptose induite par Fas soit essentiellement dépendante de l'interaction avec FADD, d'autres voies potentielles d'induction ont été décrites. Il a été notamment montré que l'activation de Fas entraîne celle des sphingomyélinases acides et neutres permettant ainsi la libération de céramides (Hetz et al., 2002). Cependant, chez les souris déficientes en sphingomyélinase acide (Santana et al., 1996) comme chez les patients atteints du syndrome de Niemann-Pick (présentant un déficit de cette enzyme) (Cock et al., 1998), la voie Fas n'est pas affectée. De ce fait, bien que le rôle exact des céramides dans la voie de Fas ne soit pas encore clairement déterminé, ils ne semblent pas directement impliqués dans l'apoptose induite par Fas (Hsu et al., 1998).

Des travaux plus récents ont cependant mis en évidence le rôle crucial des céramides dans le regroupement membranaire et la polarisation des récepteurs Fas à la membrane cellulaire. En effet, les céramides libérés par l'activation de Fas forment au niveau des microdomaines présents dans la membrane de larges domaines enrichis en céramides (Gulbins et al., 2002). Ces domaines servent de support pour le regroupement membranaire et la polarisation des molécules de récepteur Fas (Gulbins et al., 2003). Cette polarisation des regroupements membranaires est indispensable pour la transmission optimale du signal apoptotique par la voie de Fas (Cremesti et al., 2001 ; Scheel-Toellner et al., 2002).

.III Rôle physiologique et pathologique
Le récepteur de mort Fas a été identifié à l'origine comme un antigène présent à la surface cellulaire des lymphocytes B et de fibroblastes humains (Trauth et al., 1989 ; Yonehara et al., 1989). Il a depuis été montré que Fas est exprimé physiologiquement de façon constitutive dans un grand nombre de cellules tels les lymphocytes B et T activés, les hépatocytes, les cellules épithéliales du colon (Strater et al., 2000) et de l'endomètre utérin (Tanaka et al., 1999), les cellules musculaires cardiaques (Aoyama et al., 2002), ou encore les cellules endothéliales (Lidington et al., 1999). Cependant, une inactivation de la protéine Fas chez l'homme n'a de conséquence directe que sur le système immunitaire (Le Deist et al., 1996).

.III.1 Rôle dans le système immunitaire
.III.1.1 Régulation des populations lymphocytaires
Les interactions de Fas et de son ligand contrôlent la survie périphérique des lymphocytes et participent ainsi fortement au maintien de la tolérance immunitaire aux autoantigènes (Green et al., 1994. Ju et al., 1995). Le rôle du récepteur Fas dans l'élimination périphérique des lymphocytes autoréactifs a été largement mis en évidence par l'étude des souris dont le gène Fas est invalidé lpr et lprcg (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). En effet, on observe chez ces souris différents désordres auto-immuns liés à une prolifération lymphocytaire anormale, avec notamment une prolifération anarchique des lymphocytes T et leur accumulation dans la rate et les ganglions lymphatiques (hyperplasie). De plus, l'absence de délétion des lymphocytes B autoréactifs conduit à des anomalies auto-immunes liées à des autoanticorps similaires à ceux qui sont observés au cours du lupus érythémateux systémique humain. Chez l'homme, différentes mutations de Fas ont été mises en évidence, associées à un syndrome immunoprolifératif auto-immun et, plus rarement, à une lymphadénopathie massive (Fisher et al., 1995 ; Rieux-Laucat et al., 1995). De ce fait, ces études ont mis en évidence la présence d'autoanticorps dans le sérum de certains patients, (Fisher et al., 1995) montrant que la prolongation de la survie périphérique des lymphocytes B et T, consécutive à un défaut de régulation par la voie Fas, peut inhiber la sélection négative des cellules auto-immunes et l'élimination des cellules B autoréactives (Rathmell et al, 1994). De ce fait, le récepteur Fas joue un rôle capital dans la régulation des populations lymphocytaires B et T, non seulement en éliminant les lymphocytes périphériques autoréactifs, mais également en induisant l'apoptose des lymphocytes activés après leur prolifération en réponse à un antigène (Krammer P. H., 2000).

.III.1.2 Elimination des cellules pathogènes
Outre son rôle dans la régulation des lymphocytes, le récepteur Fas joue un rôle capital dans l'élimination des cellules tumorales ou infectées par un virus par les cellules T activées cytotoxiques qui expriment à leur surface le ligand de Fas. Celles-ci vont ainsi induire le suicide des cellules infectées ou en voie de tumorisation qui expriment physiologiquement le récepteur Fas (figure 8). Néanmoins, des mécanismes d'échappement à cette induction d'apoptose par le système immunitaire ont été décrits dans un grand nombre de cellules tumorales et correspondent à l'inhibition de l'expression de Fas à leur membrane (Muschen et al., 2000) ou au contraire à une expression de FasL (Whiteside et al., 2002) qui déclenche l'apoptose des lymphocytes activés spécifiques exprimant Fas. D'autre cellules, tumorales ou infectées par un virus, échappent à ce suicide induit par le système immunitaire en développant des mécanismes de résistance à l'apoptose induite par la voie de Fas tels que la sur-expression de FLIP, de Bcl2 ou de « decoy receptor » (Whiteside et al., 2002).




Figure 8 : Elimination des cellules pathogènes par les lymphocytes T CD8+.

.III.2 Système nerveux
L'apoptose est aussi un mécanisme important qui intervient de façon physiologique au cours de la formation du système nerveux embryonnaire, en éliminant les neurones surnuméraires qui n'établissent pas de connexions synaptiques fonctionnelles (Oppenheim et al., 2000). Chez l'adulte, une augmentation de l'apoptose neuronale a été impliquée dans un certain nombre de maladies neurodégénératives, telles que la sclérose latérale amyotrophique, la maladie d'Alzheimer ou lors des accidents vasculaires cérébraux ischémiques (Honig et al., 2000).

.III.2.1 Fas et neurones
Bien que la voie du récepteur Fas soit la principale voie d'apoptose décrite dans de nombreux systèmes, l'expression de Fas par les neurones est très peu documentée. Dans des conditions normales, il a été montré que Fas est exprimé transitoirement par des neuroblastes dans le cortex de rat et, de façon plus importante, à des stades plus différenciés dans des cultures primaires murines (Cheema et al., 1999). Dans des études réalisées ex vivo, l'expression neuronale de Fas a aussi été détectée par des méthodes immunohistochimiques dans le cerveau de souris juvéniles normales, sans précision cependant sur la population de neurone impliquée (Park et al., 1998). En 1999, Raoul et al. ont montré que les motoneurones embryonnaires de rat coexpriment Fas et FasL et rentrent rapidement en apoptose par la voie de Fas quand ils sont cultivés en absence de facteur trophique. L'expression de Fas a également été détectée dans les neurones de rats au cours de l'ischémie expérimentale (Sakurai et al., 1998). Toutefois, dans une étude avec des cultures de cellules issues de cerveaux de foetus humains à 12-16 semaines de gestation (Becher et al., 1998), Fas n'a pas été détecté. Enfin, l'expression de Fas par des neurones humains a été montrée dans des conditions pathologiques, comme la maladie d'Alzheimer (De la Monte et al., 1997), ou après exposition à l'interferon gamma (IFN-g) (Rensing-Ehl et al., 1996). En outre, des travaux récents suggèrent que les fonctions non-apoptotiques de Fas joueraient un rôle important dans le système nerveux. En effet, les souris lpr présentent une atrophie progressive des neurites des neurones du SNC (Sakic et al., 1998). Plus récemment, Desbarat et al. (2003) ont mis en évidence dans la lignée neuroblastique humaine SH-SY5Y et dans des cultures primaires de neurones sensitifs humains que Fas induisait la croissance neuritique, par une voie indépendante de la caspase-8, liée à l'activation des ERK.

.III.2.2 Fas et cellules gliales
Au niveau des cellules gliales, des études réalisées chez la souris ont montré une expression constitutive de Fas par les astrocytes cultivés et la microglie isolée du cerveau néonatal (Lee et al., 2000) mais chez l'homme, l'expression de Fas par les cellules gliales est controversée. Dans l'étude de Choi et al. (1999) avec des cultures primaires de cellules gliales de foetus humain ou de cerveau adulte, l'expression constitutive de Fas est limitée aux astrocytes, et peut être augmentée par l'interleukine-1, l'interleukine-6, l'IFN-get et le TNF-a. Cependant, dans une autre étude, Fas a été détecté seulement au niveau des oligodendrocytes dans le cerveau adulte (D'Souza et al., 1996), et était également inductible en présence d'IFN-g(Pouly et al., 2000). Dans une autre étude réalisée avec des cultures primaires de système nerveux central de foetus humains (12-16 semaine de gestation), l'expression de Fas a été détectée uniquement au niveau des astrocytes (Becher et al., 1998).

Troisième partie : LE SYSTEME NERVEUX CENTRAL MOTEUR
.I Développement embryonnaire
Le système nerveux (SN) embryonnaire apparaît très tôt au cours du développement, dès le 18ème jour embryonnaire chez l'homme (E18). Préalablement au développement du SN, l'embryon se compose de trois couches de cellules concentriques également appelées feuillets: l'ectoderme qui donnera l'épiderme et le système nerveux, le mésoderme qui donnera les muscles, le squelette et les tissus conjonctifs, et l'endoderme qui donnera la couche interne des viscères. Ce stade de développement s'appelle l'embryon à 3 feuillets. Le tissu nerveux apparaît à la suite d'envoi de signaux du mésoderme vers l'ectoderme. Ce phénomène, appelé l'induction neurale, se traduit par la transformation d'une partie de l'ectoderme en tissus nerveux primitif : la plaque neurale ou neurectoderme. La période pendant laquelle se forme et s'organise le neurectoderme sur la face dorsale de l'embryon correspond à la neurulation.

.I.1 La transformation du neurectoderme
Le neurectoderme va ensuite évoluer à travers 4 étapes pour former les ébauches des systèmes nerveux périphériques et centraux. Cette évolution se fait dans le sens antéro-postérieur. La différenciation du tissu nerveux primitif est précoce au niveau de la tête (partie rostrale) et plus tardive vers le bassin (partie caudale). Lors de sa formation, le neurectoderme s'épaissit par rapport au reste de l'ectoderme pour former la plaque neurale (E18) qui est marquée en son centre par un sillon neural qui suit l'axe longitudinal de l'embryon. La plaque neurale se creuse, s'invagine de manière à former la gouttière neurale. Les bords de la gouttière, les bourrelets neuraux, prolifèrent et donnent les crêtes neurales (E 20). Les bourrelets neuraux se rejoignent fermant ainsi la gouttière neurale, les crêtes neurales se séparent ensuite de l'ancienne gouttière et forment des filets continus au-dessus du tube neural primaire né de la fermeture de la gouttière. A ce moment là, le tissu nerveux est situé à l'intérieur de l'embryon, recouvert par l'ectoderme (E 21). Une fois complètement fermé, le tube neural grossit et délimite en son centre une cavité qui donnera les cavités encéphaliques et le canal de l'épendyme. La partie centrale du tube donnera la substance grise (contenant le corps cellulaires des neurones) et la partie externe de la paroi donnera la substance blanche (essentiellement les fibres nerveuses avec leurs cellules gliales). Les crêtes neurales migrent pour former les divers éléments du système nerveux périphérique, comportant les nerfs et les ganglions rachidiens ainsi que les ganglions du système nerveux autonome et des paraneurones. Dans la partie céphalique, certaines crêtes neurales constituent du mesectoderme qui formera une grande partie du squelette et du conjonctif de la face du crane et du cou.

.I.2 Précurseurs neuronaux et gliaux
Le neurectoderme présente 2 types de cellules :

- les neuroblastes, qui sont des neurones embryonnaires immatures qui peuvent encore se diviser contrairement aux neurones matures qui ne peuvent entrer en mitose. Cependant, des précurseurs neuronaux subsistent chez les mammifères adultes dans le SNC, au niveau de la couche sous-granulaire du gyrus dentelé dans l'hippocampe (Alvarez-Buylla et al., 2002 ; Kemperman et al., 2002) et la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux (Morshead et al., 1994).

- les précurseurs gliaux, qui donneront naissance aux astrocytes, oligodendrocytes, cellules microgliales, cellules choroïdiennes et cellules épendymaires dans le système nerveux central, et aux cellules gliales et cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique. Il est à noter que les cellules gliales jouent un rôle essentiel dans la différenciation (Lemke et al., 2001) et la survie des neurones (Bär et al., 2000).

.I.3 Différenciation du tube neural
.I.3.1 La moelle épinière
Le tube neural est le futur système nerveux central. La partie postérieure du tube (ou tube neural médullaire) formera la moelle épinière contenant le canal de l'épendyme issu de la cavité du tube neural. La paroi du tube neural médullaire qui donne la moelle se subdivise en substance blanche à la périphérie et en substance grise au centre. D'un point de vue fonctionnel, la moelle épinière sert d'interface entre le système nerveux périphérique et le cerveau, elle assure la conduction des influx entre ces deux structures et est aussi le centre d'activités nerveuses indépendantes, les réflexes.

.I.3.2 Le cerveau
Il est constitué à partir de la zone antérieure du tube neural (tube neural encéphalique) et apparaît pendant la période E28-E30. Cette structure va se développer considérablement pour former le cerveau embryonnaire à 3 vésicules puis, vers E 39, le stade à 5 vésicules. Ces 5 vésicules délimitent le système cavitaire cérébral qui se compose (selon l'axe rostro-caudal) des 2 ventricules hémisphériques dans le télencéphale, du 3ème ventricule dans le diencéphale, de l'aqueduc de Sylvius dans le mésencéphale et du 4ème ventricule délimité, à la fois, par le mésencéphale, le myélencéphale, et le cervelet.

.I.4 Maturation du cerveau
Le télencéphale se développe énormément en se repliant sur l'arrière et finit par recouvrir complètement le diencéphale. La différenciation du télencéphale conduit à la formation du cortex cérébral, du système limbique (les amygdales, le septum, le bulbe olfactif et l'hippocampe) et le striatum (noyaux caudés et putamen).

Le cortex continue à se développer en se plissant pour former des circonvolutions, de manière à augmenter sa surface, et se divise en 2 hémisphères cérébraux composés chacun de 4 lobes. Le lobe frontal est impliqué dans les processus cognitifs de prévision, décision et d'action préméditée (cortex préfrontal), dans la vision, le langage et la motricité (cortex prémoteur) (figure 9). Le lobe temporal est impliqué dans l'intégration de l'audition, la mémoire, l'olfaction et le langage. Le lobe pariétal centralise les informations sensitives. Et enfin le lobe occipital est spécialisé dans la vision.




Figure 9 : Le cortex moteur chez l'homme.

.I.5 Des neuroblastes aux neurones matures
.I.5.1 Différenciation neuronale et N-CAM
Les neuroblastes sont des précurseurs neuronaux issus de la division des cellules neuroépithéliales. La multiplication de ces cellules germinales débute à la 6ème semaine pour s'achever à la 20ème semaine de gestation. Ces cellules post-mitotiques perdent alors toute capacité de division et migrent à la partie externe le long des prolongements de la glie radiaire pour gagner leur zone d'implantation (Gasser et al., 1990).

L'expression de la molécule d'adhésion de cellules neuronales (N-CAM) polysialylée (PSA-NAM) va jouer un rôle fondamental au cours du développement du système nerveux central (Rutishauser et al, 1996) en modulant les interactions cellulaires.

Ainsi, la PSA-N-CAM est largement exprimée au cours du développement du système nerveux central où elle permet les migrations cellulaires en inhibant les interactions homophiliques N-CAM-N-CAM et, de façon générale, empêche les interactions cellule-cellule (Kiss et Rougon, 1997 ; Bruses et al., 1998). Elle va ainsi jouer un rôle important dans le guidage et le ciblage des axones (Tang et al., 1992 et 1994) ou la migration des précurseurs neuronaux (Ono et al., 1994 ; Hu et al., 1996) et gliaux (Wang et al., 1996). De plus, la persistance chez l'adulte de l'expression de la PSA-N-CAM dans certaines régions du système nerveux central est corrélée avec la maintenance de la plasticité des interactions cellulaires (Seki et al., 1993).

L'expression temporelle de la PSA-N-CAM est strictement régulée au cours du développement et, de ce fait, elle est exprimée uniquement au niveau des neurones immatures (Seki et al., 2002). Dans les neurones matures, seule la N-CAM est exprimée sans résidu polysialylé.

.I.5.2 Rôle des facteurs trophiques
Au cours du développement des vertébrés supérieurs, les motoneurones sont produits en excès. Dans la moelle épinière de rat, environ 6000 motoneurones sont présents au 14ème jour de la vie embryonnaire. Ces neurones vont développer un axone qui va établir un contact avec son tissu cible, le muscle squelettique qui va lui apporter des facteurs trophiques indispensables à sa survie (Hamburger, 1992). Cette compétition pour l'accès à ces facteurs de survie entraîne une sélection et environ 50% des motoneurones vont mourir jusqu'au 3ème jour post-natal. Ce mécanisme est appelé mort cellulaire physiologique des motoneurones (Oppenheim, 1991 ; Sendtner et al., 2000). Lors de la découverte du 1er facteur neurotrophique, le NGF, il a été montré que sa production par le tissus cible est nécessaire à la survie des neurones sensoriels formés (Levi-Montalcini et al., 1954). L'importance des facteurs trophiques du muscle squelettique dans la survie motoneuronale a été mis en évidence chez le poulet (Oppenheim, 1985) et plus récemment chez la souris (Grieshammer et al., 1998). Cependant, des travaux récents chez la souris ont mis en évidence le rôle capital des facteurs trophiques apportés par les cellules gliales, et tout particulièrement par les cellules de Schwann, et ce tant au cours du développement embryonnaire des motoneurones que pour leur survie chez l'adulte (Riethmacher et al., 1997).

Plusieurs facteurs trophiques capables de promouvoir la survie des motoneurones ont été aujourd'hui identifiés. Il s'agit notamment des neurotrophines (NT) BDNF (« brain-derived neurotrophic factor »), NT-3 et NT-4 mais pas le NGF (Sendtner et al., 1992 ; Hughes et al. 1993 ; Henderson et al. 1993). D'autres facteurs sont identifiés comme le CNTF (« ciliary neurotrophic factor ») (Arakawa et al., 1990), le LIF (« leukemia inhibitory factor ») (Hughes et al. 1993), le CT-1 (« cardiotrophin 1 ») (Pennica et al. 1995) ou la CLC (« cardiotrophin like cytokine ») (Pennica et al. 1995 ; Senaldi et al. 1999 ; Shi et al. 1999). Le GDNF (« glial-derived neurotrophic factor ») (Henderson et al. 1994 ; Zurn et al. 1994 ; Rakowicz et al., 2002), ainsi que l'IGF (« insuline growth factor ») (Arakawa et al. 1990 ; Hughes et al. 1993 ; Neff et al. 1993) et le HGF (« hepatocyte growth factor ») (Wong et al. 1997 ; Ebens et al. 1996 ; Yamamoto et al. 1997) permettent également la survie des motoneurones.

.I.6 Caractérisation des neurones moteurs adultes
Le neurone est une cellule capable de réagir à une stimulation en produisant un influx nerveux. C'est donc une cellule hautement spécialisée, qui permet la transmission, le traitement et le stockage de l'information. Pour cela, le neurone présente une morphologie caractéristique (figure 10). Son cytosquelette est principalement constitué de neurofilaments (NF) qui constituent la base de son architecture et jouent donc un rôle fondamental dans le maintien de son intégrité structurale et fonctionnelle comme cela est décrit dans le chapitre suivant. Au niveau de son corps cellulaire, des dendrites réalisent les connexions avec les cellules afférentes. L'axone est un prolongement du corps du neurone qui permet le transport de l'influx nerveux. L'axone présente fréquemment une gaine de myéline, discontinue au niveau des noeuds de Ranvier. Cette gaine, synthétisée par les oligodendrocytes dans le SNC et les cellules de Schwann dans le SN périphérique, joue un rôle fondamental dans la propagation de l'influx nerveux le long de l'axone. Enfin la terminaison axonale est constituée par la synapse, qui connecte les neurones entre eux. Elle est composée d'un bouton synaptique, d'un espace inter-synaptique de l'ordre de 20 nanomètres, et de la membrane post-synaptique du neurone afférant. Cette membrane est munie de canaux ioniques, de récepteurs et enzymes de régulation. Les récepteurs contrôlent l'activation de canaux ioniques de différents types. La transmission de l'information dans la synapse est réalisée par des neuromédiateurs contenus dans les vésicules synaptiques des neurones.




Figure 10 : Schéma classique d'un neurone.

Les neurones moteurs sont caractérisés par une très grande taille ce qui, par ailleurs, est fréquemment utilisé comme un des critères de leur identification (Carpenter et al., 1983 ; Morrison et al., 1996). Les motoneurones du cortex présentent en outre une morphologie pyramidale facilement identifiable du fait de leur grande taille (figure 11).

Les neurones moteurs sont localisés dans des aires motrice bien définies, dans le lobe frontal au niveau du cerveau (figure 9) et dans la partie ventrale de la moelle épinière (figure 11).

Les neurones moteurs possèdent exclusivement des synapses cholinergiques et, de ce fait, les marqueurs cholinergiques (choline acétyl-transférase et acétylcholinestérase) peuvent être utilisés comme un critère d'identification (Carriedo et al., 1996 ; Delfs et al., 1997 ; Morrison et al., 1996 ; Bär et al., 2000). Chez le poulet, il a été montré que les neurones moteurs du cortex et de la moelle épinière en cours de différenciation expriment le gène Islet-1 (Ericson et al., 1992 ; Tsuchida et al., 1994 ; Varela-Echavarria et al., 1996).

Actuellement, l'anticorps monoclonal SMI-32 (Sternberger et al., 1983), qui reconnaît un épitope de la sous-unité lourde des neurofilaments non phosphorylée des neurones cholinergiques (Mesulam et al., 1991 ; Geula et al., 1995), et marque spécifiquement les motoneurones pyramidaux et médullaires (Campbell et Morrison, 1989 ; Carriedo et al., 1995), est considéré comme un des marqueurs les plus fiables des neurones moteurs chez l'homme et le rat (Tsang et al., 2000 ; Bär et al., 2000).




Figure 11 : Motoneurones en culture mixte de cortex de rats et dans une coupe transversale de moelle épinière de rat de 8 jours.

A : Neurone moteur de rat de grande taille, avec une forme pyramidale caractéristique, de nombreuses ramifications dendritiques et un long axone. B : Marquage des motoneurones par l'anticorps SMI-32 (Herpes et al., 1999). Barre = 50 mm. C : Double-marquage sur une coupe de moelle épinière de rat âgé de 8 jours, des neurones moteurs situés dans la corne ventrale par un Ac anti-acétylcholinestérase (en noir) ; et des interneurones de la corne dorsale par un Ac anti-calrétinine (en rouge) (Kaal et al., 2000).

.II Pathologie du système nerveux central moteur : la sclérose latérale amyotrophique
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une affection neurodégénérative décrite pour la première fois par Charcot en 1874. Elle est caractérisée par la disparition progressive des motoneurones de la corne antérieure de la moelle et du bulbe rachidien, et la dégénérescence des voies pyramidales. Elle conduit à une paralysie musculaire progressive puis à la mort, souvent par paralysie des muscles respiratoires, liée à l'atteinte bulbaire. Il est à noter que plus l'âge de début de la pathologie est précoce, plus l'évolution de la maladie est rapide. Généralement, cette maladie entraîne la mort dans un délai moyen de deux à trois ans après l'identification des premiers signes cliniques. De plus, il n'existe actuellement aucun traitement curatif efficace. Cependant, fondée sur l'hypothèse excitotoxique l'utilisation du riluzole, un inhibiteur des neuro-médiateurs excitateurs, permet d'obtenir un allongement modeste de la survie (Bensimon et al, 2002).

L'incidence annuelle de la maladie est d'environ 1 à 2 cas pour 100.000 habitants et la prévalence de la forme sporadique est estimée à 4 à 6 pour 100.000 (Rowland, 1994). La maladie affecte plus souvent les hommes que les femmes dans une proportion de 1.5 pour 1. Elle peut survenir à n'importe quel âge, mais la plus grande incidence se situe entre 50-60 ans.

La SLA est généralement sporadique et seulement 10 % des cas sont familiaux (Siddique et al, 1989), avec une hérédité qui est en règle autosomale dominante. Environ 20 % de ces formes familiales autosomales dominantes sont liées à une mutation sur le chromosome 21q21 du gène de la Cu-Zn superoxide dismutase (SOD) (Rosen et al, 1994). Contrairement à la forme sporadique, il n'y a pas de différence selon le sexe.

L'étiologie de cette maladie reste inconnue. Néanmoins, des progrès considérables ont été effectués, notamment grâce à la découverte des mutations du gène codant pour la SOD chez certains sujets atteints de SLA (Rosen et al, 1993), car près de 20 % des cas familiaux sont porteurs de telles mutations (Siddique, 1996). Les causes des formes habituelles, sporadiques, restent mystérieuses. Les mécanismes pathogéniques de l'atteinte neuronale sont encore inconnus et relèvent vraisemblablement de plusieurs origines comme le suggèrent l'hétérogénéité des aspects cliniques et de l'évolutivité, qui doivent donc faire considérer la SLA comme un syndrome. Différents mécanismes pathogéniques doivent être envisagés et devraient ainsi permettre l'élaboration de stratégies thérapeutiques cohérentes. Plusieurs hypothèses pathogéniques, reposant sur des arguments cliniques et expérimentaux, sont actuellement évoquées pour la compréhension de la destruction neuronale qui pourrait relever de facteurs toxiques tels que l'excitotoxicité de l'acide glutamique et de ses analogues (Zeman et al, 1994 ; Hugon et al, 1996 ; Louvel et al, 1997), le stress oxydatif lié aux radicaux libres, les anomalies du cytosquelette (Cleveland, 1996) et l'auto-immunité (Appel et al, 1991 ; Smith et al, 1992 ; Smith et Appel, 1995). Il est possible que certains de ces différents facteurs pathogènes puissent jouer un rôle dans l'initiation du processus pathogène, ou que la pathogénèse de la SLA soit multifactorielle.

Parmi ces différentes hypothèses pathogéniques, un nombre croissant de données in vitro et in vivo suggèrent que l'apoptose est impliquée dans la dégénérescence des motoneurones observée dans la SLA. Il s'avère également que l'apoptose neuronale est associée à des dépôts d'Ig comme le rapportent des études immunohistochimiques post-mortem (Martin, 1999). Cependant, le rôle des autoanticorps dans le processus de dégénérescence des motoneurones est inconnu.

.II.1 Excitotoxicité
L'hypothèse excitotoxique dans la physiopathologie de la SLA est liée à la découverte chez les malades de taux anormalement élevés d'acides aminés excitateurs (AAE) et de leurs analogues, probablement à la suite d'anomalies de leur métabolisme. En effet, plusieurs études ont mis en évidence une augmentation significative du métabolisme des AAE, notamment du glutamate et de l'aspartate, dans le plasma et dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) des patients ayant une SLA (Plaitakis et Caroscio, 1987 ; Rothstein et al, 1990 ; Perry et al, 1990). Des niveaux élevés de glutamate peuvent être toxiques car, en activant directement les récepteurs perméables au calcium ou les canaux calciques voltages dépendants, ils induisent des niveaux élevés d'ions calcium libres. De ce fait, une anomalie de la régulation du taux de glutamate dans la synapse pourrait être à l'origine d'une dégénérescence neuronale. A la différence d'autres neurotransmetteurs tels que l'acétylcholine, il n'existe pas d'enzyme endogène de dégradation du glutamate qui est capté par des récepteurs situés au niveau des cellules gliales dont certains seraient modifiés au cours de la SLA (Rothstein et al, 1995 et 1999). Cependant, le riluzole, un inhibiteur du glutamate, a récemment été testé chez l'homme, mais les premiers essais cliniques ne permettent pas d'enrayer définitivement le processus neurodégénératif (Desai et al, 1998).

Ces changements des concentrations intrathécales et plasmatiques d'AAE dans le LCR et dans le plasma pourraient en partie résulter d'une anomalie des mécanismes de recapture. Celle-ci pourrait conduire à une augmentation des concentrations d'AAE au niveau pré-synaptique et par conséquent entraîner la mort neuronale par excitotoxicité.

En effet, la recapture du glutamate était diminuée sur des préparations de synaptosomes obtenues à partir de moelle épinière et cerveau de patients atteints de SLA (Rothstein et al, 1992). Cette diminution serait liée à la perte sélective du transporteur exclusivement glial du glutamate nommé EAAT-2 (pour « excitatory amino-acid transporter-2 ») (Bristol et al, 1996). Le niveau des ARNm de ce transporteur n'était pas modifié et cette perte serait liée à la présence d'ARNm aberrants de EAAT-2 détectés chez les patient atteints de SLA sporadique (Lin et al, 1998). L'expression in vitro de ces ARNm aberrants entraîne la perte de l'activité de la protéine EAAT-2. Curieusement, la présence de tels ARNm inhabituels ne semble pas être liée à des anomalies du gène codant pour le transporteur EAAT-2 (Aoki et al, 1998).

Dans les cultures organotypiques de moelle épinière de rat de 8 jours, l'inhibition chronique de la recapture du glutamate conduit à une mort sélective des motoneurones (Rothstein et al, 1993). Cette toxicité peut être inhibée par un antagoniste des récepteurs AMPA/ kainate (le 6-Cyano-7-NitroQuinoXaline-2,3-dione, ou CNQX). De plus, des LCR de patients atteints de SLA sont toxiques pour les neurones corticaux en culture (Couratier et al., 1993). La nature du facteur toxique reste à déterminer mais la neurotoxicité des LCR est efficacement bloquée par le CNQX, ce qui suggère que cette toxicité peut résulter de l'activation des récepteurs AMPA/ kainate. Enfin, des effets similaires sont obtenus dans un autre modèle d'inhibition de la recapture du glutamate en injectant des oligonucléotides anti-sens du transporteur au glutamate de type 1 (Rothstein et al, 1996). Ces résultats montrent qu'un déficit du transport du glutamate peut être à l'origine de la dégénérescence sélective des motoneurones.

La neurotoxicité pourrait également être liée à une augmentation du flux calcique intracellulaire par les récepteurs au glutamate AMPA (pour alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid) situés à la surface neuronale (Van Den Bosch et al., 2000). Celle-ci serait liée à l'absence de la sous-unité 2 lors de l'assemblage du récepteur (Heath et al., 2002). La faible expression de cette sous-unité 2 du récepteur au glutamate a été mise en évidence spécifiquement au niveau de neurones moteurs spinaux (Heath et al., 2002 ; Kawahara et al., 2003). De ce fait, les motoneurones seraient prédisposés aux atteintes excitoxiques par la présence majoritaire à sa surface de récepteur au glutamate ne présentant pas la sous-unité 2.

Cependant, le fait que les radicaux libres oxygénés inhibent la recapture du glutamate par les astrocytes (Volterra et al, 1994 ; Trotti et al, 1996) est un argument en faveur d'un lien entre excitotoxicité et le stress oxydatif.

.II.2 Stress oxydatif
Le transport de la cystéine à l'intérieur des neurones et des cellules gliales est toujours associé à une sortie de glutamate. Ainsi, si le niveau de glutamate extracellulaire est augmenté, ce co-transport est bloqué et la cellule n'est plus fournie en cystéine. Or, celle-ci est indispensable à la synthèse du glutathion, un anti-oxydant cellulaire qui protège la cellule des agressions induites par les radicaux libres, produits par la mitochondrie au cours de la synthèse d'ATP. De ce fait, l'augmentation de la neurotoxicité du glutamate peut entraîner un déficit en glutathion (Kato et al, 1992) et donc l'apparition d'un stress cellulaire oxydatif.

Dans une autre étude, des auteurs ont montré que la concentration plasmatique de glutathion péroxydase (une enzyme qui permet la synthèse du glutathion) est significativement diminuée chez les patients atteints de SLA (Moumen et al, 1997). Cette même étude a également montré que les concentrations plasmatiques de la Cu/Zn superoxyde dismutase (SOD) extracellulaire et de la malone dialdéhyde (un indicateur de la lipopéroxydation), sont augmentées chez les patients atteints de SLA sporadique en comparaison à des sujets témoins. Ces résultats renforcent le rôle du stress oxydatif dans la physiopathologie de la SLA.

Cependant, la théorie du stress oxydatif a pris réellement de l'importance avec la découverte de mutations dans le gène codant pour la SOD-1 chez 20% des patients atteints de formes familiales de SLA (Rosen et al, 1993). Cette enzyme catalyse la dismutation de l'O2*- en H2O2 qui est par la suite converti en radical *OH, l'espèce radicalaire la plus réactive. De ce fait, une diminution de l'activité de la SOD-1 entraîne une accumulation de l'O2*- (Olanow, 1993). L'O2*- peut interagir avec le NO pour former le radical peroxynitrite (Padmaja et Huie, 1993) qui détruit la bi-couche lipidique membranaire, oxyde les résidus thiols et méthionines des protéines (Koppenol et al, 1992), et peut aussi réagir avec la SOD-1 pour produire un radical nitronium NO2+ qui modifie les tyrosines (Beckman et al, 1992).

Toutes ces perturbations vont finalement conduirent à la dégénérescence neuronale.

En effet, dans des cultures organotypiques de moelle épinière, le blocage de la SOD-1 entraîne une apoptose neuronale dans la plupart des neurones spinaux (Rothstein et al, 1994). Or, les mutations de la SOD-1 dans la SLA familiale n'entraînent pas de modifications importantes de l'activité de la SOD (Borchelt et al, 1994). Il a été également montré que la chélation du cuivre prévient l'apoptose dans les cellules transfectées par la SOD mutée (Wiedau-Pazos et al, 1996). Ces travaux suggèrent qu'un gain de fonction de l'enzyme mutée pourrait aussi contribuer à la maladie. Les expériences avec des souris transgéniques exprimant la SOD humaine mutée soutiennent cette hypothèse (Gurney et al, 1994). En effet, ces souris développent une paralysie des membres et meurent prématurément. Sur le plan histopathologique, une dégénérescence sélective des motoneurones a lieu. Cette dégénérescence est similaire à celle qui est observée dans les tissus de patients atteints de SLA, suggérant que l'action toxique de la SOD-1 mutée serait liée à son agrégation dans les motoneurones et non pas au stress oxydatif (Bruijn et al, 1998) renforçant l'idée d'un gain de fonction de la protéine mutée.

Cependant, des travaux récents sur le modèle de SLA de souris SOD1-G93A ont mis en évidence le rôle de la cyclooxygénase (COX)-2, un enzyme qui joue un rôle important dans les cascades inflammatoires mais aussi dans les activités neuronales normales. En effet, elle permet dans les astrocytes et les neurones spinaux la synthèse de la prostaglandine E2 qui permet le relargage du glutamate par les astrocytes. D'autre part, elle joue également un rôle clé dans la production des cytokines pro-inflammatoires et des radicaux libres (Drachman et al., 2002). La neuroinflammation est une caractéristique qui affecte les tissus dans de nombreuses maladies neurodégénératives et qui a été décrite au cours de la SLA (McGeer et al., 2002). De plus, une augmentation de la COX-2 a été mise en évidence dans le cerveau et la moelle épinière de malades atteints de SLA. Chez des souris modèles SOD-1, cette augmentation a également été observée (Pompl et al., 2003) et l'inhibition de la COX-2 augmente la survie et diminue les troubles ce qui suggère une possible application thérapeutique des inhibiteurs de la COX-2 tel que le nimesulide (McGeer et al., 2002 ; Pompl et al., 2003).

.II.3 Modification du cytosquelette
Les neurofilaments (NF) constituent la base architecturale du cystosquelette neuronal. Ils sont formés par la co-polymérisation de trois protéines de la famille des filaments intermédiaires spécifiques des neurones, les sous-unités légère (NF-L), moyenne (NF-M) et lourde (NF-H) des neurofilaments. Les NF sont parmi les constituants les plus abondants des neurones, particulièrement dans les axones myélinisés tels que ceux des motoneurones spinaux. Les NF jouent également un rôle important dans le développement et le maintien du calibre axonal (Hoffman et al, 1987 ; Cleveland et al, 1991) ce qui est un déterminant crucial pour la vitesse de conduction des axones (Voyvodic, 1989). De ce fait, le dysfonctionnement des NF pourrait contribuer à la pathogénèse de certaines maladies neurodégénératives, particulièrement au cours de la dégénérescence motoneuronale dont la forme la plus fréquente est la SLA (Hirano et al, 1984).

L'étude histopathologique post-mortem de patients atteints de SLA montre que les motoneurones restants présentent des anomalies morphologiques, notamment un gonflement du corps cellulaire et une dispersion du réticulum endoplasmique (corps de Nissl) (Wakayama et al., 1992). De plus, des ballonnement axonaux, qui peuvent parfois atteindre la taille du corps cellulaire, sont fréquemment observés (Carpenter, 1968) et sont riches en NF comme ceci a été démontré en immunohistochimie (Hirano et al, 1984).

Des souris transgéniques exprimant des niveaux importants de NF-L ou de NF-H présentent des anomalies histopathologiques similaires à celles observées dans la SLA (Cote et al, 1993 ; Xu et al, 1993). De plus, différentes mutations dans le gène codant pour la chaîne lourde des NF-H ont été détectées chez des malades atteints de SLA sporadique par plusieurs équipes (Figlewicz et al, 1994 ; Tomkins et al., 1998 ; Al-Chalabi et al., 1999) mais le rôle de ces mutations reste controversé pour les formes familiales (Vechio et al., 1996). Actuellement, ces mutations des NF-H serait la cause primaire de seulement 1% des cas de SLA (Julien et Beaulieu, 2000). Dans certains cas de patients atteints de SLA sporadique, la délétion d'une partie du gène codant le domaine phosphorylé Lys-Ser-Pro a été mis en évidence pour les NF-H (Figlewicz et al, 1994), suggérant que la délétion ou la mutation du domaine phosphorylé pourrait être responsable de quelques cas de SLA. Par ailleurs, les études de souris transgéniques surexprimant le gène NF-L de souris ou humain (Lee et al, 1994) ont montré une désorganisation des neurofilaments et le développement d'une SLA expérimentale. Presque tous les motoneurones spinaux avaient un corps cellulaire élargi, ballonisé ainsi qu'un noyau excentré. Des ballonnements axonaux chargés de NF étaient aussi observés. Ces modifications sont similaires à celles qui ont été décrites dans la maladie humaine.

L'étude ultrastructurale montre que tous les compartiments des motoneurones présentent des accumulations massives de NF. Ces études indiquent que des altérations des NF peuvent conduire au dysfonctionnement neuronal et à la mort neuronale. L'accumulation anormale de NF dans la partie proximale de l'axone des motoneurones représente une des caractéristiques pathologiques de la SLA (Hirano et al, 1984). On les détecte chez plus de 70 % des patients atteints de SLA. Ce phénomène était considéré comme un effet secondaire de la dégénérescence, résultant probablement d'un transport axonal défectueux. Ainsi, l'accumulation de NF dans la partie proximale de l'axone des motoneurones pourrait résulter de l'augmentation de la synthèse de novo des NF et la diminution de leur dégradation. Elle pourrait également résulter de la présence de mutations ponctuelles des gènes codant pour les NF ou de l'altération des NF par les radicaux libres (Chou et al., 1996), entraînant une désorganisation et une diminution du transport axonal (Robertson et al., 2002). Par ailleurs, l'accumulation anormale de NF dans les neurones lésés s'accompagne souvent de la diminution de concentration de l'ARNm codant pour NF-L. Notamment, une diminution de 60 % de l'ARNm de NF-L était rapportée dans les motoneurones des patients atteints de SLA (Bergeron et al, 1994). Une telle réduction de la synthèse des NF pourrait entraîner une plus grande fragilité des axones et une diminution de leur calibre. En outre, il est possible que la réduction de la synthèse de NF-L dans la SLA, perturbant la stoechiométrie, pourrait contribuer à la formation de dépôts de NF.

De plus, des modifications post-traductionnelles (hyperphosphorylation) qui peuvent influencer la formation des NF et conduire au blocage du transport axonal des NF, ont été évoquées. En général, dans plusieurs types neuronaux, les NF phosphorylés sont exclusivement présents dans les axones et les dendrites. Au cours de la SLA, on note la présence de NF phosphorylés dans les corps cellulaires des motoneurones (Rao et al., 1995). Cependant, des travaux récents montrent que cette hyperphosphorylation est un phénomène secondaire lié à l'accumulation des NF décrite auparavant (Strong et al., 2001). Toutefois, il a également été montré dans les souris SOD que cette hyperphosphorylation pourrait être consécutive à une dérégulation de la cdk5 (« cyclin-dependant kinase 5 ») (Patzke et al., 2002 ; Nguyen et al, 2003).

Des travaux plus récents mettent en évidence le rôle d'une autre protéine du cytosquelette de 57 kDa, la périphérine, qui comme les neurofilaments fait partie des filaments intermédiaires neuronaux. La surexpression de cette protéine chez des souris entraîne la mort sélective des motoneurones (Beaulieu et al., 1999). De plus, son expression est augmentée de 300% après une lésion du nerf sciatique (Troy et al., 1990) alors que l'expression des 3 sous-unités des neurofilaments diminue (Muma et al., 1990). La surexpression de la périphérine va entraîner la formation d'inclusions de filament intermédiaire au niveau du périkaryon et de l'axone des neurones moteurs comme ceux retrouvés au cours de la SLA (Robertson et al., 2002).

.II.4 Autoimmunité
En plus des hypothèses précédentes, il existe de nombreux arguments pour penser que des dysfonctionnements du système immunitaire contribuent au processus dégénératif motoneuronal. Cette hypothèse repose sur la détection en immunohistochimie de dépôts d'immunoglobulines (Ig) de la classe des Ig G dans les motoneurones de malades (Engelhardt et Appel, 1990 ; Fishman et Drachman, 1995). De plus, les sérums de SLA ou leur fraction immunoglobulinique g sont toxiques pour les neurones in vitro (Wolfgram et Myers, 1973 ; Alexianu et al, 1994). Enfin, la fréquence élevée d'Ig monoclonales dans 60 % des sérums de SLA pourrait révéler également un dysfonctionnement du système immunitaire (Duarte et al, 1991).

Les données expérimentales sont également en faveur d'un mécanisme autoimmun. Des modèles animaux reproduisant la maladie ont été obtenus après immunisation de cobayes avec des neurones moteurs de moelle épinière bovine (Engelhardt et al, 1989). Ce modèle a mis en évidence que l'immunisation spécifique d'animaux avec des motoneurones pouvait reproduire un équivalent de maladie humaine, caractérisée par une destruction motoneuronale associée à la présence d'anticorps spécifiquement dirigés contre les neurones moteurs, à des dépôts d'Ig G au niveau des jonctions neuromusculaires et des motoneurones dans la moelle épinière mis en évidence par immunohistochimie. Des modèles expérimentaux murins de cette maladie ont aussi été obtenus par le transfert passif de sérums de SLA (Appel, et al, 1991). Plus récemment, il a été montré que l'injection à des souris d'Ig G, extraites de sérums de malades atteints de SLA, permet de reproduire les anomalies ultrastructurales observées dans les motoneurones au cours de la SLA avec, en outre, un augmentation de la concentration calcique intracellulaire, prouvant que les Ig G présentes dans les sérums de malades ont un effet cytoxique sur les motoneurones (Pullen et al., 2000).

Les spécificités fines ainsi que les mécanismes pathogéniques de ces autoanticorps ne sont pas actuellement parfaitement définis. Concernant la cible antigénique, des autoanticorps anti-glycosphingolipides, dirigés soit contre le ganglioside GM1 (Li et Pestronk, 1991) soit contre le sulfoglucuronyl-paragloboside (Ben Younes-Chennoufi et al, 1995), ont été détectés dans 4 à 6 % des cas de SLA sporadiques (Sanders et al, 1993). Par ailleurs, des titres élevés d'anticorps anti-GM1 ont été détectés dans 5 à 10 % des sérums de SLA (Pestronk, 1991).

D'autres spécificités d'autoanticorps ont été décrites, notamment des IgG dirigées contre les canaux calciques voltage-dépendants (sous-unité L) de la jonction neuro-musculaire (Kimura et al, 1994). Ces anticorps ont été détectés par ELISA (« Enzyme-linked immunosorbent assay ») dans le sérum de 75 % de malades atteints de SLA (Smith et al, 1992, Offen et al., 1998). De plus, ces IgG anti-canaux calciques étaient cytotoxiques pour une lignée murine de cellules hybrides neuroblastiques motoneuronales (Smith et al, 1994). Enfin, des autoanticorps d'isotype ml, dirigés contre les neurofilaments sont détectés dans 25 % des sérums de SLA sporadiques (Couratier et al, 1998).

Bien qu'un grand nombre d'études soutiennent l'hypothèse autoimmune dans la pathogénie de la SLA, les traitements immunosuppressifs ou immunomodulateurs testés à ce jour n'ont pas fait la preuve de leur efficacité dans cette maladie, qu'il s'agisse de corticothérapie par voie intrathécale, de plasmaphérèses (Olarte et al, 1980), de traitements par cyclophosphamide (Smith et al, 1994), cyclosporine (Appel et al, 1988) ou d'Ig par voie intra-veineuse (Dalakas et al, 1994). Deux hypothèses découlent donc de ces données : les désordres immunitaires pourraient être précoces et inducteurs de la perte motoneuronale mais inaccessibles à l'effet des traitements immunomodulateurs classiques (Drachman et al, 1994) ; ou la réponse autoimmune est une réponse secondaire à des lésions motoneuronales primitives, relevant d'un autre mécanisme.

Des travaux récents ont cependant également mis en évidence le rôle du récepteur pour le fragment constant des Ig G dans la pathologie de la SLA. Celui-ci permettrait, au niveau des synapses, l'internalisation des IgG plasmatiques dans les motoneurones. Ces Ig serait alors transportées de façon rétrograde au niveau du corps cellulaire motoneuronal où elles stimuleraient alors l'augmentation du calcium intracellulaire entraînant un processus neurotoxique (Obal et al., 2002) ainsi que le relargage d'acétylcholine au niveau de la terminaison axonale (Mohamed et al., 2002).

.II.5 Rôle de l'apoptose dans la SLA
La mort neuronale intervient au cours du vieillissement normal. Cependant elle peut avoir lieu de façon pathologique dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et la SLA. Ces maladies sont caractérisées par la perte de sous-populations spécifiques de neurones. Le rôle d'un déficit en facteurs trophiques a été évoqué comme étiologie possible de ces maladies. Les mécanismes conduisant à la mort neuronale peuvent dépendre de phénomènes de nécrose et d'apoptose, comme cela a été démontré dans un modèle excitotoxique (Bonfoco et al, 1995). La prédominance d'un de ces deux mécanismes serait sous la dépendance de l'intensité et de la durée de l'exposition à ce facteur toxique (Nath et al, 1998). Plusieurs études suggèrent que l'apoptose intervient dans la mort des motoneurones au cours de la SLA (Alexaniu et al, 1994 ; Yoshiyama et al, 1994 ; Troost et al, 1995).

Le rôle de l'apoptose dans les maladies neurodégénératives fait l'objet d'un important débat. Ainsi, l'apoptose a été détectée par TUNEL (« Terminal deoxynucleotide transferase-mediated dUTP Nick-End Labeling ») sur des tissus post-mortem au cours de la maladie d'Alzheimer et de la SLA (Troost et al, 1995). Le rôle de l'apoptose dans la dégénérescence neuronale a été argumenté par les données expérimentales mettant en évidence une induction d'apoptose neuronale par des sérums de malade atteints de SLA (Alexianu et al, 1994). Par ailleurs, il a été montré que les auto-anticorps anti-canaux calciques entraînaient l'apoptose d'une lignée de motoneurones (Alexianu et al, 1994). Plus récemment, Martin et al. (1999) ont montré, au niveau de la corne antérieure de la moelle épinière et du cortex moteur de malades atteints de SLA, la présence d'apoptose, détectée par des critères morphologiques et la fragmentation de l'ADN, ainsi que l'activation de la caspase-8.

Les dernières études soutiennent l'hypothèse que l'apoptose jouerait un rôle dans le processus de la mort neuronale au cours de la SLA (Mattson, 2000 ; Sathasivam et al., 2001) et suggèrent l'implication de la protéine pro-apoptotique anti-tumorale p53 qui est surrexprimée dans les neurones moteurs et les astrocytes au cours de la SLA (Martin, 2000).

MATERIELS ET METHODES
.I Conditions de cultures cellulaires
.I.1 Lignées humaines
.I.1.1 Lignée lymphocytaire T Jurkat
La lignée lymphocytaire T Jurkat est une lignée cellulaire dont les cellules poussent en suspension. Elles a été entretenue en flasques de 75 cm2 dans du milieu RPMI 1640 (Gibco, Paisley, UK) supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal (Seromed, Berlin, Allemagne) décomplémenté (SVFd) par 30 minutes de chauffage à 56°C, 2 mM de L-glutamine, 50 UI / ml de pénicilline, 50 mg / ml de streptomycine et 0,1 % de fungizone (Gibco). Les cultures étaient maintenues à 37°C dans un incubateur sous 5 % CO2, en atmosphère humide (95 %).

.I.1.2 Lignée neuroblastique SH-SY5Y
La lignée SH-SY5Y est une lignée neuroblastique issue du sous-clonage de la lignée hétérogène SK-N-SH (Muller et al., 1988). Elle a été cultivée dans le même milieu que la lignée Jurkat additionné de 10 % de pyruvate de sodium (Gibco). Comme il s'agit d'une lignée adhérente, le réensemencement des cellules nécessite un traitement par 0,25 % de trypsine (Gibco) pendant 10 minutes à 37°C. Après inactivation de l'enzyme par addition de milieu supplémenté en SVF, les cellules sont centrifugées à 100 g pendant 10 min, puis ensemencées à différentes densités selon les expérimentations (comme décrit dans le chapitre suivant) et maintenue en culture pendant au moins 3 jours avant toute expérimentation.

.I.1.3 Ensemencement des lignées
- 2 x 104 cellules par puits dans les chambres de culture à 8 puits (Lab-Tek, Nunc, VWR, France) pour les marquages en immunofluorescence indirecte et les études d'apoptose par TUNEL.

- 104 cellules par puits dans les plaques de 96 puits (Nunc) pour les tests immunoenzymatiques d'étude de l'apoptose par ELISA-apoptose (Méthode de dosage des cellules apoptotiques par dosage des nucléosomes solubles intra-cytoplasmiques).

- 105 cellules dans les flasques de 75 cm2 dans du milieu RPMI 1640 pour l'entretien des cellules ou les cultures réalisées pour extraction de protéines.

.I.2 Cultures primaires de système nerveux central
.I.2.1 Cultures mixtes de cerveaux et de moelles épinières de rat
Des rates à 16 jours de gestation, période à laquelle débute la différenciation neurale chez le rat, sont sacrifiées et les embryons prélevés. Les cultures sont réalisées à partir de cerveaux ou de moelles épinières prélevées sur les rats foetaux à 16 jours de gestation (E16). Les conditions de culture sont adaptées de celles de Tardieu et al. (1986).

Le cerveau ou la moelle épinière de chaque foetus est prélevé stérilement sous loupe binoculaire, puis disséqué dans du milieu basal de Eagle avec sels de Earles (MBE) (Life technology, France). Les méninges sont retirées afin de limiter la contamination fibroblastique. Les prélèvements sont ensuite fragmentés avec des ciseaux puis dissociés par incubation avec 0.25 % de trypsine à 37°C pendant 10 minutes. La dissociation est interrompue par l'adjonction de SVFd contenu dans le milieu de culture. Il s'agit de MBE supplémenté par 10 % de SVFd, 6 g/l de glucose (Sigma), 2,5 g/l de bicarbonate de sodium (Sigma), 1 % de glutamine, 1 % de pénicilline-streptomicine et 0.1 % fungizone. Les cellules sont sédimentées par centrifugation (800 g pendant 10 minutes). Le culot est alors repris dans du MBE supplémenté puis homogénéisé pour comptage cellulaire à la cellule de Malassez.

Environ 3.105 cellules sont ensemencées dans des puits de 14 mm de diamètre. Il s'agit soit de plaques 24 puits (Nunc) dans lesquels ont été déposées des lamelles de verre préalablement stérilisées et recouvertes de collagène (Calbiochem, San Diego, CA) ; soit des chambres de culture à 4 puits en verre, également recouvertes de collagène. Les cultures sont maintenues à 37°C et 5 % de CO2 en atmosphère humide. La totalité du milieu de culture est changée au 2ème jour de culture pour éliminer les débris cellulaires puis le milieu est renouvelé par moitié tous les 3 jours. Les divisions cellulaires rapides (astrocytes, fibroblastes) sont bloquées par l'addition de 10-5M de cytosine-arabinoside (Sigma, Saint Louis, MO) pendant 24 h au début de la confluence cellulaire, entre les 5ème et 7ème jours de culture (Jauberteau et al., 1993).

.I.2.2 Cultures de neurones humains
Les cultures primaires de neurones humains sont réalisées avec des cerveaux et des moelles épinières de foetus humains âgés de 9 semaines issus d'interruption volontaire de grossesse par aspiration. Ces travaux suivent les règles du comité d'éthique national français et ont été approuvés par le comité d'éthique régional de l'hôpital universitaire de Limoges (n° 89-11 et 95.01.01). Pour chaque culture, les cellules corticales ou spinales issues de 3 foetus sont rassemblées.

Le cerveau et la moelle épinière de chaque foetus est identifié sous loupe binoculaire selon des critères morphologiques. Après retrait des méninges, ils sont ensuite disséqués stérilement puis dissociés selon les conditions précédentes. Les cellules sont ensuite ressuspendues dans du milieu de culture complet, puis ensemencées dans des chambres de culture à 4 puits en verre recouvertes de collagène avec 5.105 cellules par puits.

Les cultures sont maintenues à 37°C et 5 % de CO2 en atmosphère humide. La totalité du milieu de culture est changée au 2ème jour de culture pour éliminer les débris cellulaires puis le milieu est renouvelé par moitié tous les 3 jours. Les divisions cellulaires rapides (astrocytes, fibroblastes) sont bloquées par l'addition de cytosine-arabinoside dans les conditions décrites précédemment.

.II Sérums humains
Les sérums humains ont été prélevés avec le consentement éclairé des personnes et conservés à -80°C jusqu'à leur utilisation.

Nous avons utilisé au cours de cette étude 31 sérums (17 hommes et 14 femmes) de malades atteints de SLA sporadique (Brooks et al., 1994) dont la moyenne d'âge au moment du prélèvement était de 64 ans. Nous avons également étudié 33 sérums (13 hommes et 20 femmes) de contrôles sains qui proviennent du centre de transfusion sanguine (CTS) dont la moyenne d'âge au moment du prélèvement était de 61,5 ans. Nous avons aussi testé, à titre de contrôle neurologique, 27 sérums de malades atteints de maladie d'Alzheimer 6 sérums de patients souffrant d'une paraplégie post-traumatique survenue dans les 3 à 6 mois précédant le prélèvement.

Les taux d'anticorps anti-glycosphingolipides ont été déterminés dans le laboratoire d'Immunologie du CHU de Limoges (Jauberteau et al., 1990). Tous les sérums, de contrôles sains et de malades, sont négatifs afin d'écarter les syndromes moteurs apparentés à la SLA (neuropathies motrices à blocs de conduction).

.III Dosage du FasL soluble dans les sérums humains
Le taux de FasL soluble a été déterminé dans les sérums humains à l'aide d'un test ELISA commercial (soluble FasL ELISA Kit, Diaclone, Besançon, France) suivant les instructions du fournisseur.

Le dosage du FasL dans les sérums normaux a été utilisé comme référence. Un taux de FasL, dans les sérums de SLA, supérieur à la moyenne de celui des sérums contrôle sains plus 2 déviations standards a été considéré comme positif.

.IV Conditions de stimulation des cellules
.IV.1 Etude de l'apoptose induite par les sérums humains dans les cellules de la lignée neuroblastique humaine ou des cultures primaires de cerveaux et de moelles épinières de rat
Afin d'étudier les mécanismes de la mort neuronale induite par les sérums de SLA, les cultures primaire de cerveaux et de moelles épinières de rats ont été incubées pendant 24h avec les sérums (malades ou contrôles) dilués au 1/10 dans le milieu de culture.

L'effet apoptotique des sérums (malades ou contrôles) a également été étudié sur les cellules de la lignée neuroblastique SH-SY5Y après exposition pendant 48h ou 72h à ces sérums dilués au 1/10.

.IV.2 Etude de l'apoptose induite par la voie Fas dans les cellules des lignées humaines ou des cultures primaires de SNC murin et humain
Le rôle de Fas dans l'apoptose a été étudié en incubant les cellules des lignées ou des cultures primaires avec différents inducteurs ou inhibiteurs de la voie de Fas dans les conditions décrites dans le tableau suivant.

Nom Nature Concentration finale Fournisseur
Z-IETD-FMK inhibiteur irréversible de la caspase-8 50 mM Calbiochem
Z-DEVD-FMK inhibiteur irréversible de la caspase-3 50 mM Calbiochem
B-G34 IgG1 de souris anti-Fas
Sans effet sur les lymphocytes humains 100 mg/ml Diaclone
B-G27 IgG2a de souris anti-Fas
Agoniste de Fas sur les lymphocytes humains 100 mg/ml Diaclone
B-D29 IgG1 de souris anti-Fas
Antagoniste de Fas sur les lymphocytes humains 100 mg/ml Diaclone
B-K14 IgG1 de souris anti-Fas 100 mg/ml Diaclone
Soluble FasL protéine recombinante humaine surnageant de
cellules COS 20 ng / ml Diaclone
sFasL « Super Fas ligand » humain recombinant 20 ng / ml Alexis Biochemicals



.V Séparation des cellules par la technique de fractionnement par couplage flux - force de sédimentation (SdFFF)
.V.1 Principe de la SdFFF
La SdFFF permet en un temps limité, sans marquage préalable, et en respectant l'intégrité cellulaire, de séparer des cellules hétérogènes en fonction de leurs différentes propriétés physico-chimiques : taille, densité et forme. Ainsi, à densité égale, les particules de plus grande taille seront éluées avant les particules de plus faible diamètre.

Les conditions de séparation (force du champ externe appliqué et flux de phase mobile) doivent être déterminées spécifiquement dans nos conditions. Le respect de la viabilité cellulaire de cette technique à été montré au cours de l'étude de l'élution de différents types cellulaires tels que des fibroblastes de plexus choroïdes de moutons ou des cellules neurales de cerveaux d'embryons de rat. Aucun accroissement spécifique de la mortalité cellulaire n'a été détecté après élution en SdFFF.

Cette technique a été réalisée par le Dr S. Battu, dans le laboratoire de Chimie Analytique et Bromatologie du Pr P. Cardot à la Faculté de Pharmacie de Limoges.

.V.2 Préparation des cellules
Le système de séparation est décontaminé par une solution à 3 % d'hypochlorite de sodium, suivi d'un rinçage durant une nuit par de l'eau distillée stérile et apyrogène. Quelques heures avant utilisation, cette phase mobile est remplacée par une solution de PBS stérile additionné de 50 UI / ml de pénicilline, 50 mg / ml de streptomycine et 0,1 % de fungizone (PBSa).

Les cellules de la lignée neuroblastique SH-SY5Y ont été lavées une fois avec du PBS stérile, puis séparées par un solution de 0,25 % de trypsine (Gibco) en PBS pendant 10 minutes à 37°C. La trypsine est inactivée par l'adjonction de milieu de culture complet contenant du SVFd. Les cellules sont alors lavées puis remises en suspension dans du PBSa. Une fraction est prélevée pour une numération à la cellule de Malassez. La viabilité cellulaire est réalisée par la méthode d'exclusion au bleu trypan ajouté à la suspension cellulaire, à la concentration finale de 0,1 % ; les cellules colorées en bleu sont considérées comme mortes. La concentration cellulaire est ajustée à la concentration finale de 106 cellules viables / ml. Cette suspension cellulaire constitue la population cellulaire totale des cellules SH-SY5Y (PT).

.VI Etudes immunocytochimiques et immunohistochimiques par immunofluorescence indirecte
L'expression des protéines dans les cellules a été recherchée par immunofluorescence indirecte (IFI) dans les différentes lignées cellulaires, dans les cultures mixtes de SNC murines et humaines ou bien sur des coupes histologiques de cerveaux et de moelles épinières.

La technique du double-marquage en immunofluorescence va permettre d'une part, de rechercher la co-expression de deux protéines distinctes dans les cellules. D'autre part, dans les cultures mixtes neurales, l'IFI permet de vérifier la présence d'autoanticorps dirigés contre des constituants du système nerveux dans les sérums humains ou l'expression de protéine à l'aide d'un premier marquage, tout en identifiant les types cellulaires à l'aide du second.

.VI.1 Fixation des cellules en culture
Après un lavage en PBS, les cellules sont fixées avec une solution de paraformaldéhyde à 4 % en PBS pendant 30 minutes à température ambiante (TA) puis lavées 3 fois en PBS. Les cellules non adhérentes de la lignée lymphocytaire T Jurkat sont alors fixées rapidement par séchage sur une lame en verre pour immunofluorescence à 16 puits, recouverte de poly-D-Lysine (Sigma). Pour la détection d'antigène intracellulaire, les cellules sont perméabilisées par une solution à 90 % d'éthanol glacial pendant 1 minute et lavées 3 fois en PBS ; ou bien par une solution à 10 % de triton X100 en PBS pour la détection d'apoptose par la méthode TUNEL.

.VI.2 Préparation des coupes de tissus
Cette technique a permis de détecter et caractériser au niveau des constituants du système nerveux central la réactivité des sérums de patients atteints de SLA et l'expression de la protéine Fas.

Pour l'étude du système nerveux central murin, les moelles épinières de rats adultes ont été prélevées après dissection du rachis puis rapidement congelées dans l'azote liquide. Des coupes transverses de 5 mm sont réalisées au cryostat et fixées pendant 10 minutes à l'acétone glacial.

Pour l'étude du système nerveux central humain, le cerveau et la moelle épinière d'un embryon humain âgé de 10 semaines, obtenu après une interruption non-thérapeutique de grossesse, ont été prélevés puis rapidement congelés à -80°C. Des coupes de 12 mm sont réalisées dans le plan sagittal pour les hémisphères cérébraux et transversal pour la moelle épinière dorsale.

Les cryosections sont collectées sur des lames Superfrost/Plus slides (Menzel-Glazer, Freiburg, Allemagne), séchées à l'air libre puis conservées à -80°C pour les études immunohistochimiques.

.VI.3 Anticorps primaires
Une étape de saturation visant à bloquer les sites de fixation non spécifique est réalisée par l'incubation des lames avec une solution saturante de sérum d'agneau normal (SAN) à 10 % dans du PBS pendant 30 minutes à TA.

Les cellules sont ensuite incubées avec un (simple marquage) ou deux (double marquage) anticorps primaires pendant 2 heures à TA.

Un contrôle isotypique est systématiquement effectué pour chaque anticorps primaire, avec selon les cas, des immmunoglobulines irrelevantes IgG1 ou IgG2a purifiées chez la souris (Immunotech, France).

.VI.3.1 Détection des réactivités d'autoanticorps sériques avec la lignée neuroblastique
Pour la détection d'autoanticorps dans les sérums de malades atteints de SLA ou de contrôles normaux et neurologiques, les cellules ont été incubées avec ces sérums dilués au 1/100 dans la solution saturante, pendant trois heures à température ambiante.

.VI.3.2 Détection spécifique d'antigène cellulaire
La liste des anticorps primaires utilisés au cours de cette étude, leur spécificité, leur dilution et leur fournisseur sont indiqués dans le tableau suivant (tableau II).

Après incubation avec l'anticorps primaire, les cellules sont lavées 3 fois dans du PBS.

Tableau I. Activateurs et inhibiteurs de la voie Fas
Nom Antigène Hôte Isotype Couplage Dilution Fournisseur Propriété
SMI-32 NF-H
(200 kDa)
non
phosphorylé souris Ig G1 1/1000 Affiniti, Mamhead,
UK Marqueur des
neurones moteurs
B-G27 Fas humain souris IgG2a Aucun
FITC
Phycoérythrine 1/50
1/5
1/5 Diaclone
Besançon
France
B-D29 Fas humain souris IgG1 1/50 Diaclone
B-G30 Fas humain souris IgG1 1/50 Diaclone
B-G34 Fas humain souris IgG1 1/50 Diaclone
Anti-AchE Enzyme
acétylcholine
estérase Lapin P 1/50 Santa Cruz
Biotechnology Marqueur des
neurones
cholinergiques
Anti-GFAP Protéine gliale
fibrilliaire
acide lapin P 1/100 Dako
Glostrup Danemark Marqueur des
astrocytes
Ki-M7 CD-68 souris IgG1 1/100 Dako Marqueur des
cellules
microgliales
NN18 NF-M
(160 kDa) souris Ig G1 1/100 Dako Marqueur des
cellules
neuronales
2F11 NF-L
(68 kDa) souris Ig G1 1/50 Dako Marqueur des
cellules
neuronales
NKH-1 N-CAM souris IgG1 Phycoérythrine 1/5 Dako Coulter,
Fullerton, CA,
USA



* P: polyclonal

.VI.4 Anticorps secondaires
Les cellules sont incubées avec l'anticorps secondaire pendant 30 minutes à TA. Le type d'anticorps secondaire utilisé dépend de l'espèce et de l'isotype de l'anticorps primaire (tableau précédent). Pour chaque expérience, l'absence de fixation non spécifique de l'anticorps secondaire est testée avec des cellules non exposées préalablement à un anticorps de première couche.

Les anticorps secondaires sont couplés à la fluorescéine ou à la rhodamine pour les études en double-marquage. Pour les études réalisées en microscopie confocale, les anticorps secondaires sont couplés à un conjugué Alexa fluor 594 ou 488.

Un des anticorps secondaires est parfois couplé à la biotine pour permettre une amplification du signal au cours d'une étape supplémentaire d'incubation (30 minutes à TA) avec un complexe streptavidine-FITC (1/200 en PBS, Dako, Glostrup, Danemark) ou streptavidine-phycoérythrine (1/200 en PBS, Immunotech, Marseille, France) ou streptavidine-Alexafluor 594 (1/2000, Molecular Probes, Leiden, Netherlands).

La liste des anticorps secondaires utilisés est indiquée dans le tableau III.

Après 3 lavages dans du PBS et un rinçage rapide à l'eau, les cellules sont montées entre lame et lamelle dans une solution de glycérol-gélatine (Gibco) et observées au microscope à fluorescence (Zeiss) ou en microscopie confocale (Zeiss, LSM510).

Tableau II. Tableau des anticorps primaires utilisés en immunofluorescence indirecte.
SPECIFICITE HOTE CONJUGUE FOURNISSEUR DILUTION
Ig totales de lapin Chèvre Biotine Dako 1/500
Ig totales humaines Chèvre Biotine Amersham
Les Ulis, France) 1/1000
Ig totales de souris Lapin Rhodamine Dako 1/200
Ig G1 de souris Chèvre Biotine The Binding Site
(Grenoble, France) 1/100
Ig G2a de souris Chèvre Biotine The Binding Site 1/100
Ig G1 de souris Chèvre FITC Southern Biotechnology
(Birmingham, UK) 1/100
Ig totales de souris Lapin FITC Dako 1/200
Ig totales de souris Chèvre Alexa Fluor
488 Molecular Probes
Leiden, Netherlands 1/2000
Ig totales d